《European Journal of Cell Biology》：Response of the bovine oviduct epithelium to sperm binding and proximity: a region-specific proteomic approach using spheroids
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本研究聚焦精子在输卵管内的运输、储存与受精前调控，针对以往研究难以区分精子与输卵管上皮细胞(OECs)的直接结合与单纯邻近效应的问题，研究人员采用蛋白质组学方法，对比分析了牛输卵管峡部与壶腹来源上皮细胞球体在精子结合、邻近接触下的蛋白质组响应。研究发现，精子与上皮细胞的物理结合引发比单纯邻近效应更显著的蛋白质丰度变化，且这种响应具有明显的区域特异性，同时揭示了精子结合可能通过调控纤毛运动、代谢及分泌蛋白等功能，在维持精子活力、调节免疫反应和促进受精方面发挥关键作用。该工作为深入理解受精前雌性生殖道微环境的精细调控提供了新视角。
在哺乳动物的受精前奏曲中，精子经历了一段漫长而曲折的旅程。当精子离开子宫，进入输卵管的狭长通道后，一个有趣的现象发生了：一部分精子会“停靠”在输卵管峡部的上皮细胞上，形成一个临时的“精子库”。与此同时，另一些精子则继续向上游的壶腹挺进，那里是卵子等待的地方，它们也可能与沿途的上皮细胞发生短暂接触。这场发生在输卵管深处的细胞间“对话”，对于维持精子活力、调控其适时释放并确保成功受精至关重要。然而，长期以来，科学家们面临一个难题：这些紧密附着在细胞上的精子，与那些只是在“附近游荡”的精子，对输卵管上皮细胞的影响究竟有何不同？此外，作为精子旅途中不同“驿站”的峡部与壶腹，其上皮细胞对精子的“接待”方式又是否有别？这些问题由于体内研究的复杂性和传统细胞模型的局限性，一直悬而未决。为了揭开这层神秘面纱，Coline Mahé及其同事在《European Journal of Cell Biology》上发表了一项研究，利用前沿的蛋白质组学技术和创新的细胞球体模型，对精子与输卵管上皮细胞的这场“区域特异性对话”进行了深入解码。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们利用从屠宰场成年母牛获取的输卵管，分离并培养了具有生理相关性的峡部和壶腹部输卵管上皮细胞球体模型，该模型能维持细胞极性和纤毛功能。其次，研究设计了精密的共培养实验体系，将上皮细胞球体分为与精子直接共培养（接触组）、通过0.4微米孔滤器与精子共培养（非接触组）以及无精子的对照组，以区分精子结合与邻近效应的不同影响。第三，采用纳米液相色谱-串联质谱联用技术对共培养后的细胞球体进行了大规模、定量的蛋白质组学分析。最后，利用流式细胞术评估了共培养体系中游离精子的膜和顶体完整性，以探究上皮细胞对精子活力的影响。
研究结果
3.1. 结合精子在球体表面单位面积的密度
研究证实，共培养6小时后，通过短暂涡旋可以几乎完全移除附着在球体上的精子，为后续纯化的上皮细胞球体蛋白质组分析奠定了基础。
3.2. 游离精子的膜和顶体完整性
流式细胞术分析显示，与无球体的对照组相比，与壶腹部细胞球体在非接触条件下共培养，有提高精子膜和顶体完整性的趋势（p = 0.07）。这表明壶腹部上皮细胞的分泌物可能有助于维持精子的活力。
3.3. 输卵管解剖学起源和精子相互作用对球体蛋白质组的全局性影响
蛋白质组学分析共鉴定出6989个蛋白质。主成分分析显示，细胞来源（峡部 vs. 壶腹部）是导致样本差异的主要因素。研究人员共发现了609个差异丰度蛋白。与精子单纯邻近（非接触组 vs. 对照组）相比，精子直接结合（接触组 vs. 对照组）在上皮细胞球体中引发了更多数量的DAPs。更重要的是，在峡部和壶腹球体中，由精子结合或邻近引发的DAPs仅有少量重叠（5-23%），凸显了响应的区域特异性。
3.4. 峡部球体对精子结合与邻近的响应
在峡部球体中，精子结合与邻近导致DAPs显著富集在与纤毛运动和结构（如AKAP3， AKAP4， ODF2）、单羧酸代谢过程以及对有毒物质和饥饿的应答等功能通路上。这暗示精子结合可能刺激了纤毛相关蛋白的合成，以适应额外的机械负荷并提供所需能量。
3.5. 壶腹部球体对精子结合与邻近的响应
在壶腹部球体中，精子接触后丰度增加的DAPs则与有鞭毛精子运动、有氧呼吸、单羧酸代谢过程、蛋白质定位建立的调控以及宫内胚胎发育等功能密切相关。特别值得注意的是，一些与血液凝固调控（如FETUB， AHSG， APOA1）和受精过程（如透明质酸酶SPAM1）相关的蛋白丰度发生了特异性变化。
3.6. 分泌蛋白的预测与功能分析
在精子结合与邻近诱导的上调蛋白中，分别有33%（峡部）和33%（壶腹部）被预测为分泌蛋白。这些分泌蛋白中包括在两侧都出现的SPAM1、GPX4和PEBP4，它们的功能涉及有鞭毛精子运动、细胞对氧水平的反应等。这表明精子相互作用可能显著促进了输卵管上皮细胞向管腔分泌特定蛋白质，这些分泌物可能直接作用于精子或受精微环境。
结论与讨论
本研究有力支持了最初的两个假设：1) 精子直接结合与单纯邻近诱导输卵管上皮细胞产生了不同的蛋白质组响应；2) 这种响应在峡部和壶腹上皮细胞之间存在显著差异。此外，研究还首次在蛋白质组层面揭示，壶腹部上皮细胞的存在（即使没有直接接触）可能有助于维持精子的膜和顶体完整性。
研究发现的区域特异性响应可能反映了峡部与壶腹在受孕过程中的不同生理角色。峡部的响应集中在纤毛功能和代谢适应上，这可能有助于在“精子库”中稳定储存精子并调控其释放。而壶腹部的响应则更紧密地与受精准备和免疫调控（通过凝血相关通路）相联系，例如上调的FETUB蛋白被认为可以防止卵子透明带过早硬化，而上调的SPAM1可能有助于精子穿透卵丘细胞。
特别有趣的是，精子结合引发了纤毛运动相关蛋白（如AKAP3， AKAP4， ODF1， ODF2）的上调。这些蛋白在含有20-25%有活性纤毛细胞的球体基础表达中被检测到，其上调更可能源自上皮细胞自身，是对精子附着带来的额外机械负荷的一种适应反应，旨在维持或增强纤毛运动能力，这可能对精子在输卵管中的进一步运输或卵子/胚胎的运输至关重要。
该研究也存在一些局限性，例如未模拟发情周期激素环境、使用的精子浓度高于生理水平、以及采用非获能培养基等。尽管如此，这项工作首次在接近生理的三维模型上，系统地区分并刻画了精子结合与邻近效应对输卵管不同区域上皮细胞蛋白质组的差异化影响，揭示了雌性生殖道为迎接精子所做的主动而精细的分子准备。它不仅深化了我们对精子-雌性生殖道对话机制的理解，也为改善辅助生殖技术、开发新型避孕手段或诊断生殖障碍提供了潜在的新靶点和思路。
