《European Journal of Medicinal Chemistry》：Broad-Spectrum Inhibitor of Non-Structural Protein 2 Protease Shows Therapeutic Efficacy Against Venezuelan Equine Encephalitis Viral Infection
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本研究发现三种结构的新型nsP2蛋白酶抑制剂，具有广谱抗病毒活性，其中候选药物BFB78在代谢稳定性和体内疗效方面表现优异，有效降低小鼠脑内病毒载量，为开发抗托卡病毒属药物提供新方向。
Olawale S. Adeyinka|Damilohun S. Metibemu|Tamia Hampton|Jane-Frances Chinenye Ojobor|Olamide Crown|John Falode|Michael D. Barrera|Farhang Alem|Aarthi Narayanan|Ifedayo Victor Ogungbe
美国阿拉巴马州亨茨维尔市阿拉巴马大学科学学院化学与生物技术科学与工程系，邮编35899
摘要
nsP2蛋白酶在病毒复制过程中起着关键作用，为开发针对 togaviruses 家族的窄谱和广谱直接抗病毒药物提供了独特的机会。在本研究中，我们发现了几种高效的广谱 nsP2蛋白酶抑制剂，这些抑制剂几乎可以抑制所有 Togaviridae 家族的病毒，并且具有转化潜力，因为它们能够选择性地阻断细胞培养中的病毒复制。这三类高效抑制剂分别基于 C5-取代的吡咯、四氢喹啉或吲哚骨架。主要候选化合物 BFB78 在暴露于小鼠和人类肝脏的一期和二期代谢酶时具有代谢稳定性，在小鼠血浆中具有良好的浓度，并能穿过血脑屏障。在致命的 VEEV 感染小鼠模型中，BFB78 的治疗效果达到 100%，并且以 50 mg/kg 体重剂量使用时，能够将脑内的病毒滴度降低四个数量级以上。目前正在进行更多关于 BFB78 以及基于吲哚的 nsP2 蛋白酶抑制剂的临床前研究。此外，含有四氢喹啉基团的抑制剂似乎对 BFV、ONV、CHIKV 和 MAYV 具有窄谱活性。
引言
神经嗜性病毒，如 togavirus 家族的新世界 alphaviruses，对全球公共卫生构成了严重威胁。自 2019 年以来，美国多个州报告的东部马脑炎（EEE）病例显著增加，尤其是在东北部地区。西部马脑炎病毒（WEEV）、东部马脑炎病毒（EEEV）和委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）是能够引起人类脑炎和其他严重神经系统疾病的神经侵袭性新世界 alphaviruses。这些虫媒病毒主要通过蚊子传播，可能导致从轻微发热和头痛到癫痫发作、昏迷甚至死亡等多种临床表现。由于担心通过节肢动物传播或生物恐怖主义手段释放病原体可能引发疫情，人们加大了开发应对措施的力度。Alphaviruses 拥有一个约 12 千碱基的单链 RNA 基因组，该基因组分为两个开放阅读框，分别编码非结构多蛋白和结构多蛋白。nsP2 蛋白酶在三个识别位点进行蛋白水解切割，生成四种成熟的非结构蛋白：nsP1、nsP2、nsP3 和 nsP4，这些蛋白在宿主细胞胞质中协调病毒的 mRNA 转录和翻译。nsP2 蛋白质包含一个具有核苷三磷酸酶（NTPase）活性的 N-末端螺旋结构域和一个 C-末端蛋白酶结构域，后者与一个缺乏典型催化残基的甲基转移酶（MTase）类似结构域相连。除了参与多蛋白加工外，nsP2 还能转移到细胞核中，抑制宿主细胞的转录并抑制先天抗病毒反应。鉴于其在病毒复制和免疫逃逸中的关键作用，nsP2 成为了一个潜在的药物靶点。抑制 nsP2 蛋白酶活性不仅可以抑制病毒 RNA 的合成，还能恢复宿主细胞对 alphavirus 感染的有效先天免疫反应。在早期研究中，我们发现 nsP2 蛋白酶抑制剂能够成功阻断委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的复制。从最初发现以来，我们的研究重点在于寻找具有更好 体内 代谢稳定性、高效广谱抑制作用以及在动物模型中具有治疗活性的 nsP2 蛋白酶类似物。最近，我们对两种优化化合物 N83 和 N85 的作用机制进行了全面研究。这两种化合物在 体外 对 VEEV 显示出强抗病毒活性，对 WEEV 和 EEEV 的活性较弱，而 N85 在致命的 VEEV TC-83 小鼠模型中提供了保护作用。在此基础上，我们继续寻找高效且生物可利用的 nsP2 蛋白酶抑制剂，理想情况下应具有针对 WEEV、EEEV、VEEV、Mayaro 病毒（MAYV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、O'nyong-nyong 病毒（ONV）和 Barmah Forest 病毒（BFV）、Sindbis 病毒（SINV）以及 Highland J 病毒（HVJ）的广谱活性，并在经过验证的 VEEV 感染小鼠模型中显示出 体内 效果。在结构-活性关系（SAR）研究中，我们考虑了多种类似片段的骨架，以扩展我们之前报道的抑制剂（如 J13、N20、N85）的化学空间，如图 1 所示。本文报道了几种高效的广谱蛋白酶抑制剂，以及一种在体内对 VEEV 感染具有治疗效果的代谢稳定 nsP2 蛋白酶抑制剂。
化合物合成与纯化
BFA 和 BFB 系列化合物（表 S1）是根据先前描述的方法（参考文献 13, 14）以及图 1、图 2、图 3、图 4 中所示的合成路线，从 tert-丁基 (E)-(3-(甲基磺酰)烯丙基)氨基甲酸 (N-5-3) 或 tert-丁基 (S, E)-(4-(甲基磺酰)丁-3-烯-2-基)氨基甲酸 (N73-ST3) 及其相应的羧酸合成的（BFC-BFH 系列的合成路线见图 4）。BM100、BM101、BM103 和 BM105 分别属于 BFC、BFD、BFF 和 BFH 系列，其合成方法如下所述。
BM100：三乙胺（TEA，...
nsP2 蛋白酶的高效抑制剂
抑制实验表明，有三类骨架化合物对至少一种 nsP2 蛋白酶具有亚微摩尔级的抑制活性，包括四氢喹啉类（例如 BFB07R）、吲哚类（例如 BFB02）和吡咯类（例如 BFB78）。如表 1 和表 S1 所示，四氢喹啉类抑制剂对 CHIKV、MAYV 和 VEEV 的 nsP2 蛋白酶具有更高的选择性；而吲哚类和吡咯类抑制剂则具有广泛的广谱活性。
结论
本研究鉴定了一个生物可利用的 alphavirus nsP2 蛋白酶抑制剂，该抑制剂具有广谱抗病毒活性，并在致命 VEEV 小鼠模型中显示出 体内 效果。此外，基于四氢喹啉的抑制剂优先抑制 MAYV、CHIKV、ONV、BFV 和 VEEV 的 nsP2 蛋白酶；而含有取代吡咯和吲哚基团的抑制剂则对整个 alphaviruses 家族具有广泛的活性。一个令人惊讶的发现是，尽管...
作者贡献声明
Farhang Alem：方法学研究、数据分析。Aarthi Narayanan：资源获取、方法学设计。Ifedayo Victor Ogungbe：写作与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目监督、软件使用、资源管理、方法学研究、资金筹集、数据分析、概念构思。Olawale S. Adeyinka：写作与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据分析、数据管理。利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
Ifedayo Victor Ogungbe 持有 Biomolecular Science, LLC 的股权，并拥有由杰克逊州立大学授予的关于马脑炎病毒共价抑制剂的专利（美国专利号 11,905,249）。其他作者声明没有已知的可能影响本研究报告工作的财务利益或个人关系。数据获取
数据可应要求提供。资助
本研究部分得到了 美国国立卫生研究院下属的 国家过敏和传染病研究所（资助编号：R21AI159740 和 G20AI67408）的资助。此外，阿拉巴马大学亨茨维尔分校、医学化学、生物、放射与核（CBRN）防御联盟（OTA - W15QKN-16-9-1002；与 Battelle Memorial Institute 合作），以及 Biomolecular Science, LLC 也提供了支持。内容仅代表作者观点，不一定代表官方立场。? 作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Ifedayo Victor Ogungbe 表示获得了国家过敏和传染病研究所的财务支持；同时与 Biomolecular Science, LLC 有股权或股票关系；并持有相关专利。
致谢
我们感谢德克萨斯大学西南医学中心临床前药理学核心实验室的 Noelle Williams 教授提供的技术支持，同时也感谢科罗拉多大学博尔德分校蛋白质组学和质谱共享研究资源的 Chris Ebmeier 博士和 Dave McCall 的协助。我们非常感谢
美国国家过敏和传染病研究所的抗病毒项目（APP）提供的巨大支持。
