《European Journal of Medicinal Chemistry》：Structure-based discovery of a novel allosteric activator of ATG4B for the treatment of triple-negative breast cancer
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靶向白血病治疗的新型BET蛋白PROTACs设计及优化：基于ABBV-075的临床抑制剂，通过系统优化连接子长度/组成及E3配体（CRBN/VHL），开发出高效降解BET蛋白的PROTACs A10和A12。体外实验显示两者显著抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡及周期停滞；体内实验中A10（6 mg/kg）和A12（2 mg/kg）分别使移植瘤体积抑制76.2%和60.5%。药效学评估表明A10安全性更优，兼具肝肾功能毒性低和高效抗肿瘤特性，为AML治疗提供新候选药物。
魏青云|张健|陈乔|蔡旭婷|周金培|王波|张慧斌|曹鹏
江苏省医学创新中心，南京中医药大学中西医结合医院，中国江苏省南京市210028
摘要：
针对溴结构域和末端外区域（BET）蛋白是治疗急性髓系白血病（AML）的一种有前景的策略。然而，传统BET抑制剂的临床开发受到剂量相关毒性和补偿性耐药性的限制。蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）通过泛素-蛋白酶体系统降解目标蛋白，提供了一种具有催化作用且通常更具选择性的替代方案。在这项工作中，我们基于临床抑制剂ABBV-075设计并合成了一系列新型BET PROTACs。通过系统优化连接子长度/组成和E3连接酶配体（CRBN或VHL），我们发现了两种高效PROTACs，即A10（基于CRBN）和A12（基于VHL）。这两种化合物均能有效降解BET蛋白，抑制细胞增殖，诱导细胞周期停滞，并在MV4-11 AML细胞中促进细胞凋亡。在MV4-11异种移植模型中，A10（6 mg/kg）和A12（2 mg/kg）显示出显著的肿瘤生长抑制作用（分别为76.2%和60.5%）。全面的药物相似性评估表明，尽管A12在药代动力学研究中表现出更高的全身暴露量，但A10的安全性更好，肝肾毒性最小。A10良好的疗效-安全性平衡凸显了其作为AML治疗临床候选药物的强大潜力。本研究强调了合理的PROTAC优化如何产生具有增强治疗窗口的降解剂，为AML中的靶向蛋白降解提供了有希望的前进方向。
引言
组蛋白尾部的赖氨酸残基乙酰化是一种关键的翻译后修饰，可调节多种生物过程。含有溴结构域的蛋白质（BRDs）能够特异性识别组蛋白上的乙酰化赖氨酸，并作为表观遗传读码器来调控基因转录和下游事件[1]。在这些蛋白质中，溴结构域和末端外区域（BET）家族成员——BRD2、BRD3、BRD4以及睾丸特异性BRDT，是癌症和其他疾病的重要治疗靶点[2]、[3]、[4]。BET抑制剂（+)-JQ1的发现[5]推动了众多BET抑制剂（BETi）[6]、[7]、[8]、[9]的开发，其中一些已进入癌症治疗的临床试验[10]（图1）。然而，许多临床试验因剂量限制的毒性（DLTs）而终止。例如，高剂量OTX015在造血病患者中使用时会导致严重的不良反应，包括胃肠道紊乱、贫血和血小板减少[11]。I-BET762也观察到了类似的DLTs[12]、[13]。此外，高剂量的BETi可能导致BRD4积累，从而削弱c-Myc的抑制作用并降低治疗效果[14]。总体而言，这些发现强调了需要新的策略来靶向BET蛋白。
与小分子抑制剂不同，蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）以亚化学计量方式降解蛋白质。它们已成为有前景的治疗剂和生物及药物发现工具[15]。在过去五年中，超过20种PROTACs进入了临床试验[16]。与传统抑制剂相比，PROTACs具有多种优势，包括能够靶向原本无法成药的蛋白质[17]、克服药物耐药性[18]、[19]、[20]、[21]、降低毒性[22]、[23]，以及提高目标选择性和组织选择性[25]。
已经开发了一系列BET PROTACs（图1B），在临床前研究中显示出良好的疗效[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。首个报道的BET PROTAC dBET1将JQ1与CRBN E3连接酶配体沙利度胺连接起来。它在体外和体内有效降解BRD2-4，抑制白血病进展[29]。相比之下，MZ1是一种招募CRL2VHL E3复合物的BET PROTAC，由于形成三元复合物时产生了VHL-BRD4相互作用，因此优先降解BRD4而非BRD2和BRD3[31]。王团队进一步优化了BET配体和连接子组成，开发出了BETd-260和QCA570，这两种化合物在异种移植模型中均表现出强烈的降解和肿瘤抑制作用[26]、[27]。总体而言，这些结果突显了靶向降解在治疗癌症和其他疾病方面的治疗潜力。
此前，我们报道了BET PROTACs 1和2的发现，这两种PROTAC都招募CRBN E3连接酶[32]、[35]。PROTAC 1可选择性地降解BRD2和BRD4，在造血细胞和实体瘤细胞中表现出强烈的抗增殖作用[32]。PROTAC 2源自临床候选药物ABBV-075和来那度胺（图1），它保留了与BRD4的结合亲和力，并在BxPC3胰腺癌细胞中表现出强烈的抗增殖作用[35]；然而，还需要进一步的结构优化和深入的机制研究。因此，在这项工作中，我们从PROTAC 2出发，探索了连接子的优化，重点关注连接子的组成和长度以及E3连接酶配体，从而得到了一系列高效的BET PROTACs。其中，A10和A12在MV4-11白血病细胞中表现出出色的BET降解和生长抑制作用。在体内实验中，A10和A12在MV4-11异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤活性，并具有可接受的安全性。
部分摘要
BET PROTAC的设计
在我们之前的研究中，晶体学检查和分子对接显示ABBV-075中吡咯环的2位位于结合口袋之外，对该位置的替换不会显著影响BRD4的亲和力[35]。基于这一发现，我们确定化合物2是一种高效的BRD4 PROTAC和针对BxPC3人类胰腺癌细胞的抗增殖剂。如报道所述，连接子设计[40]和E3连接酶的选择[41]在PROTAC介导的作用中起着关键作用
化学
BET配体3、关键中间体7以及化合物A1-A4的合成方法与之前的研究[35]相同。化合物A5-A11的合成过程见方案1。化合物9a-9g是通过在磷氧氯（POCl3）存在下，将8a-8f与CRBN E3连接酶配体4和5进行酰胺化反应制备的。然后在酸性条件下进行叔丁氧羰基（Boc）脱保护，得到化合物10a-10gA5-A11
结论
本研究强调了BET PROTACs的治疗潜力，表明它们能够选择性地降解BET家族蛋白并抑制肿瘤增殖。在ABBV-075的结构基础上，我们优化了连接子和E3连接酶的招募方式，得到了具有强大生化和细胞活性的新型PROTACs。其中，A10和A12在降解效率和异构体选择性方面表现突出。A10优先降解BRD4
化合物合成
除非另有说明，所有试剂均从商业渠道购买，无需进一步纯化。高分辨率质谱数据使用Agilent QTOF 6520仪器记录。核磁共振（NMR）谱数据在Bruker AV-300 MHz或Bruker Avance NEO 400 NMR谱仪上以ppm（δ）为单位记录，TMS参考峰为δ = 0。信号分裂模式分别表示为单峰（s）、双峰（d）、三峰（t）或多峰（m），耦合常数（J）以赫兹为单位。熔点通过RY-1仪器测量
作者贡献声明
张健：验证、监督、方法学设计、实验研究、数据分析。蔡旭婷：验证、监督、方法学设计。陈乔：验证、软件开发。王波：初稿撰写、资金申请、数据分析。周金培：实验研究、数据分析、数据管理。曹鹏：撰写、审稿与编辑、资源协调、项目管理、资金申请、数据管理、概念构思。张慧斌：撰写、审稿与编辑、实验研究利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金杰出青年学者项目（编号：82125037）、国家重点研发计划（编号：2023YFC2308200）、济南市“新高中20项”项目（编号：202333006）、泰山学者计划（编号：tstp20231239）以及国家自然科学基金（编号：82373717）的支持。
