构建中国舌鳎（Cynoglossus semilaevis）的多组织免疫图谱，揭示了粒细胞的功能适应性及其潜在的调控机制

《Fish & Shellfish Immunology》：Construction of a multi-tissue immune atlas for Chinese tongue sole ( Cynoglossus semilaevis) reveals granulocyte functional adaptation and underlying regulatory mechanisms

中国舌鳎多组织免疫细胞图谱的构建与粒细胞亚群特征解析。本研究通过整合血液、肝脏、脾脏和肾髓质的单细胞RNA测序数据，系统鉴定了五个转录特征不同的粒细胞亚群（Gr1-Gr5），揭示其发育轨迹源于肾髓质和脾脏的共祖池，并受CXCR2/CXCR4轴和分支特异性转录因子的调控。各亚群在炎症反应、免疫调节和补体活性方面具有功能分化，且呈现显著的 tissue-specific分布模式。研究还发现亚群间通过保守的CD44B介导的模块进行通讯，为鱼类免疫适应机制及病害防控提供新框架。

　　

李亚楠|张向辉|李硕|刘翔|黄英毅|王红岩|刘凯强|王倩|刘玉燕|邵长伟

上海海洋大学渔业与生命科学学院，上海201306，中国

摘要

硬骨鱼的先天免疫在很大程度上依赖于粒细胞来抵御病原体。然而，这些细胞如何适应不同的组织微环境在功能上仍知之甚少。为了解决这个问题，我们通过整合来自血液、肝脏、脾脏和头部肾脏的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，构建了半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）的多组织免疫图谱。我们识别出五种在转录上不同的粒细胞亚群（Gr1-Gr5），每种亚群在炎症反应、免疫调节和补体活性方面具有不同的作用；此外，这些亚群在组织中的分布也各不相同。伪时间分析显示，它们从位于头部肾脏和脾脏中的共同祖细胞池开始分化，其分化过程受到cxcr2/cxcr4轴和特定分支转录因子动态表达的调控。尽管这些粒细胞亚群共享核心代谢途径，但它们在组织中表现出特定的适应性，并且存在一种通过cd44b介导的信号传导机制。我们的发现系统地描述了硬骨鱼模型中粒细胞的适应模式，为鱼类免疫学和水产养殖疾病控制提供了新的见解。

引言

随着全球水产养殖业的迅速发展，传染病已成为一个主要威胁，导致重大经济损失并阻碍了该行业的可持续发展1, 2, 3。鱼类依靠复杂的免疫系统来适应多样化的水生环境4, 5。除了对水产养殖疾病控制的重要性外，鱼类免疫学还为脊椎动物免疫系统的进化提供了基础性的理解6。在过去的几十年中，鱼类的重要免疫器官（如头部肾脏、脾脏和肝脏）已被确定为造血和免疫调节的主要场所7, 8, 9。在这些器官和循环血液中，先天免疫的主要效应细胞被产生并动员起来以维持宿主防御。

粒细胞是先天免疫的核心介质，作为抵御病原体的第一道防线10, 11。它们是最早被招募到炎症部位的白细胞之一，在那里活化的中性粒细胞通过释放细胞内毒性颗粒、产生活性氧（ROS）和形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来发挥强大的细胞毒性作用12, 13, 14, 15。除了直接的抗菌作用外，粒细胞还参与炎症反应的诱导、调节和消退10。这些功能特性在硬骨鱼和中性粒细胞的哺乳动物对应物中是保守的。值得注意的是，有证据表明，与哺乳动物相比，鱼类粒细胞可能表现出更长的寿命和更广泛的功能多样性16, 17。此外，粒细胞本身在功能上是异质的18, 19。它们的分化和成熟会产生不同的亚群，每个亚群可能都预先编程了特定的功能。这种多样性进一步受到组织特异性微环境的影响，例如在小鼠模型中存在多种分子上不同的中性粒细胞亚群20。然而，鱼类粒细胞组织驱动的功能特化的分子机制仍不清楚。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）的出现以前所未有的分辨率革新了免疫复杂性的研究能力，使得能够识别稀有亚群、重建分化轨迹并阐明细胞特异性的分子程序21。尽管scRNA-seq已在多种重要的鱼类模型中得到应用，但针对组织特异性免疫异质性的深入探索仍然有限22, 23, 24, 25, 26。半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是一种具有经济价值的海洋扁平鱼类，其养殖生产经常受到病原体爆发的影响27, 28, 29, 30。虽然之前的研究已经报道了这种鱼类的NETs形成和抗菌活性31，但尚未在单细胞水平上系统地描述粒细胞群体。因此，构建详细的多组织免疫细胞图谱对于阐明粒细胞的适应机制和制定抗病品种的育种策略至关重要。

在这里，我们通过整合来自血液、头部肾脏、脾脏和肝脏的scRNA-seq数据，生成了半滑舌鳎的全面多组织免疫细胞图谱。我们专注于解析异质性的粒细胞群体，旨在定义它们的分子多样性、重建它们的分化轨迹，并描述支持其功能适应的组织特异性调控网络。这项工作为理解硬骨鱼中粒细胞可塑性和先天免疫的进化提供了新的见解，为开发水产养殖疾病管理策略奠定了基础。

实验伦理和动物

所有涉及动物的实验程序均遵循中国海洋渔业科学院黄海渔业研究所实验动物伦理委员会批准的指南（YSFRI-2026006）。本研究中使用的成年半滑舌鳎来自中国山东省青岛市的水产市场。这些鱼在控制条件下饲养，水温为24±1°C，盐度为16±0.5‰。

样本收集和细胞制备

外周血

半滑舌鳎多组织免疫细胞图谱的构建和功能表征

为了构建半滑舌鳎的全面免疫细胞图谱，我们对成年鱼的外周血进行了scRNA-seq分析，生成了四个独立的文库。这些数据随后与来自主要免疫器官（包括肝脏、脾脏和头部肾脏）的已发表的单细胞数据集进行了整合25。经过严格的质量控制后，我们获得了超过70,000个高质量血细胞的基因表达谱（数据S1）。为了平衡不同组织中的细胞数量

讨论

本研究通过整合来自血液、肝脏、脾脏和头部肾脏的scRNA-seq数据，构建了半滑舌鳎的全面多组织免疫图谱25。这一综合资源系统地揭示了粒细胞的组织分区和功能异质性，为理解这些关键先天免疫细胞如何适应硬骨鱼中的不同组织微环境提供了高分辨率的框架。

通过区分五种不同的粒细胞亚群

CRediT作者贡献声明

李亚楠：概念提出、方法设计、软件开发、数据分析、初稿撰写、可视化。张向辉：实验设计。李硕：撰写、审稿与编辑。黄英毅：撰写、审稿与编辑。刘翔：撰写、审稿与编辑。王红岩：监督。刘凯强：数据管理。王倩：撰写、审稿与编辑。刘玉燕：撰写、审稿与编辑。邵长伟

数据可用性

半滑舌鳎的血液scRNA-seq数据已存放在国家基因组数据中心（Genome Sequence Archive，GSA: CRX1449394-CRX1449397）59, 60。

资助

本研究得到了国家重点研发计划（2022YFD2400100）、山东省泰山学者计划基金、国家****专项支持、青岛国家海洋科学技术实验室支持的AoShan人才培育计划（2017ASTCP-ES06）、中央公共利益科学机构基础研究基金CAFS（2023TD19）的支持。

利益冲突声明

我们声明作者之间不存在利益冲突。