黑米（Oryza Sativa L.）中花青素的酶促酰基化：对其对抗食源性病原体细菌作用的研究

《Food Bioscience》：Enzymatic acylation of anthocyanin from black rice ( Oryza Sativa L.): Researches on its antibacterial effects on foodborne pathogens

黑米花青素通过Novozym 435脂酶催化与癸酸酰化生成衍生物ACD，显著增强了对李斯特菌、金黄色葡萄球菌等食源性病原体的抑菌活性，其MIC降低50%-87.3%。机制研究显示ACD破坏细菌细胞壁和膜通透性，导致核酸泄漏（增346.43%）、ATP酶活性下降（4.58 U/mL），并抑制三羧酸循环（85.2%）。该研究为开发天然食品防腐剂提供了新思路。

　　

刘书云|王慕文|纳加萨·梅尔加|孙汉菊|何书东

安徽工业大学食品与生物工程学院，安徽省农产品加工重点实验室，中国合肥230009

摘要

在本研究中，为了提高黑米花青素的抗菌潜力以应用于食品保存，我们首先分离出了氰苷-3-O-葡萄糖苷（C3G），然后使用Novozym 435脂肪酶作为催化剂将其酰化。所得衍生物被鉴定为氰苷-3-O-(6″-癸酰)-葡萄糖苷（ACD）。这种酶法改性成功地实现了目标，因为ACD对主要食源性病原体的抗菌活性显著增强。其对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的最小抑制浓度分别比前体C3G低50.00%-87.30%。经过ACD处理后，细菌细胞表现出扭曲和凹陷的形态。细胞壁和膜的通透性严重受损，表现为细胞外碱性磷酸酶活性增加了78.57%-346.43%，核酸泄漏增加了60%-73.5%。此外，ACD还干扰了细胞内功能，使腺苷三磷酸酶和超氧化物歧化酶的活性分别降低了4.58 U/mL和4.88 U/mL，并抑制了三羧酸循环85.2%。研究表明，酶法酰化是一种有效的策略，可以通过多靶点机制增强黑米花青素的抗菌效果，这表明ACD作为天然食品防腐剂的潜力很大。

引言

食源性病原体是食品安全的主要问题，因为它们会导致微生物疾病、食品变质、健康问题以及食品产业的经济损失。在食品预处理、加工和储存过程中，这些病原体可能会从感染源传播开来（Qiao, Fu, & Li, 2020）。与食源性疾病爆发相关的主要病原体包括单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌，以及它们的有毒代谢物（Fathali et al., 2025）。例如，单核细胞增生李斯特菌可以定植并侵入宿主上皮细胞，导致严重的并发症，如败血症、脑膜炎和母婴感染（Liu et al., 2024）。同样，金黄色葡萄球菌是一种与血管或皮肤感染相关的病原微生物，而肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌可引起伤口感染、腹泻、胃肠炎和败血症（Kim, Yang, & Kim, 2023; Zhu et al., 2025; Zhu et al., 2025）。

几十年来，化学防腐剂被广泛用于抑制微生物并延长食品的保质期。然而，大多数化学防腐剂对人类的潜在危害以及微生物在长期使用后可能产生的抗性极大地限制了它们的广泛应用。因此，全球范围内有越来越多的研究致力于发现具有更好安全性的“绿色”或天然防腐剂。一些多酚、多糖、多肽、植物提取物和花青素已被报道具有抑菌作用（Azarashkan et al., 2022; Shizari, Davoodi, Hassani, Amiri, & Hassani, 2025）。其中，花青素属于黄酮类多酚，其基本结构由两个通过3个碳原子连接的苯环组成。花青素广泛分布于植物中（如叶子、花朵、果实和茎），赋予植物鲜艳多样的颜色。它们具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性，可能有助于降低肥胖、糖尿病和心血管疾病的风险（Karimi Sani et al., 2025）。来自蓝莓、覆盆子和蔓越莓的花青素能够显著抑制单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7。Gong等人（2020）发现蔓越莓花青素可以抑制金黄色葡萄球菌，其最小抑制浓度（MIC）为5 mg/mL。经过10 mg/mL的花青素处理0.5小时后，金黄色葡萄球菌中的ATP和可溶性蛋白质减少，细胞膜受损。随后，当花青素添加到煮熟的牛肉和猪肉中时，金黄色葡萄球菌的菌落数量显著减少。类似地，蓝莓花青素也能有效抑制单核细胞和大肠杆菌O157:H7（Lacombe, Tadepalli, Hwang, & Wu, 2013）。然而，上述研究中使用的材料是花青素提取物；因此，特定花青素单体的抗菌效果仍不清楚。因此，有必要获得花青素单体并研究它们的抗菌效果。

黑米，通常被称为紫米，是一种独特的糯米品种，因其双重用途而在传统医学和烹饪中备受重视。它富含多种必需营养素，包括淀粉、蛋白质、脂质、粗纤维、维生素和矿物质。特别是，黑米被认为是花青素最丰富的天然来源之一，在有色谷物中花青素含量最高（Cao et al., 2025）。黑米花青素的主要单体是C3G，占总花青素的约88%。此前，我们不仅从黑米中提取并纯化了C3G，还研究了其稳定性、抗氧化性和益生元活性。然而，C3G不稳定，在光照、氧气、高温、金属离子、氧化酶和强碱的作用下容易氧化。为了提高其稳定性和生物活性，对其分子结构进行了修饰。例如，使用不同链长的脂肪酸对C3G进行了修饰，如来自高山熊果（Yang et al., 2018）、红葡萄酒（Cruz et al., 2017）和黑醋栗（Yang et al., 2018）的C3G。通过辛酸酰化的C3G的热稳定性、热稳定性和脂溶性得到了提高（Leonarski et al., 2025）。迄今为止，研究主要集中在酰化花青素的合成和稳定性上。然而，酶法酰化同时提高黑米衍生C3G的稳定性和抗菌效果的潜力尚未得到充分探索。特别是，对其作用机制的全面理解，尤其是对其对病原体能量代谢的影响，仍然缺乏。这一知识空白阻碍了其作为新型食品防腐剂的开发。

在本研究中，从黑米中纯化的氰苷-3-O-葡萄糖苷（C3G）使用辛酸作为酰基供体进行了酶法修饰，得到了相应的酰化衍生物氰苷-3-O-葡萄糖苷癸酰酯（ACD）。首先通过测定其对食源性病原体单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌的最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）来评估ACD的抗菌潜力。进一步通过观察形态变化、碱性磷酸酶（AKP）和核酸的泄漏、细胞内酶的活性以及TCA循环的完整性来探讨ACD对病原体的抗菌机制。这些发现为未来在食品保存中的应用提供了理论基础。

材料与化学试剂

黑米粗花青素提取物（总花青素含量≥25%，w/w）购自天津康友生物技术有限公司（中国天津）。Novozym 435脂肪酶（来自Candida antarctica的固定化脂肪酶B；CAS 9001-62-1；活性≥10,000 U/g（丙基月桂酸测定），重组蛋白，表达在黑曲霉中）由诺维信公司（丹麦Bagsv?rd）提供。分子筛（4 ?，1/16”颗粒）、癸酸（CAS 334-48-5，纯度≥98.0%）、叔戊醇

ACD的结构表征

用辛酸对C3G进行酶法酰化后，通过半制备型HPLC纯化了产物（图1a）。在9.83分钟处明显出现了一个C3G峰，MS₁为449，MS₂为287（图1b）。在21.16分钟处出现的较晚洗脱峰被鉴定为酰化衍生物（ACD）。如图1c所示，MS₁中出现了一个分子离子信号峰，M⁺为603，这正是通过酯键与癸酰连接的C3G的分子量

结论

本研究通过使用Novozym 435脂肪酶催化的酶法酰化，成功地合成了黑米花青素氰苷-3-O-葡萄糖苷（C3G）的酰化衍生物。所得产物经纯化后被鉴定为氰苷-3-O-(6″-癸酰)-葡萄糖苷（ACD），这是通过葡萄糖苷部分的单酰化实现的。然后系统地评估了ACD对关键食源性病原体（包括单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌的抗菌效果。

作者贡献声明

梅尔加·纳加萨：写作 – 审稿与编辑。孙汉菊：写作 – 审稿与编辑，资金获取。刘书云：写作 – 原稿撰写，软件使用，方法学设计，数据整理，概念构建。王慕文：写作 – 审稿与编辑，软件使用。何书东：写作 – 审稿与编辑，资金获取

未引用的参考文献

Fathali Beygi et al., 2025; Jun-Won et al., 2018; Liu et al., 2025; Liu et al., 2025; Qiao et al., 2020; Zhu et al., 2025.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

伦理声明

我们的研究不需要进一步的伦理委员会批准，因为它不涉及动物或人体临床试验，也不违反伦理原则。根据《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则，所有参与者在参与研究前均提供了知情同意。参与者的匿名性和保密性得到了保障，参与完全是自愿的。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用了DeepSeek来提高手稿的可读性和语言表达。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

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致谢

本研究得到了教育部生物过程研究中心的支持。本文的分析工作部分在合肥工业大学仪器分析中心完成。作者还感谢中国中央高校的基础研究基金（PA2024GDSK0092, PA2025GDGP0026）的财政支持。