从咸鸭蛋清中提取溶菌酶的电膜分离技术：工艺优化与结构-功能特性研究

《Food Bioscience》：Electromembrane Fractionation of Lysozyme from Salted Duck Egg White: Process Optimization and Structural-Functional Characterization

咸鸭蛋废料中溶菌酶的高效回收及其特性研究，采用电磁膜过滤技术优化参数（1:1.5稀释比、400mA电流密度、360分钟），实现48.9%回收率，产品纯度高、结构完整、热力学性质优异且保留抗菌活性，为高盐蛋白废料资源化提供新方法。

　　

何淑东|邱敏秋|王远洋|金彤|叶永康|瓦利德·埃尔法莱（Walid Elfalleh）|牛天娇|肖冉|孙汉柱

中国安徽省合肥市合肥工业大学食品与生物工程学院，教育部生物过程工程研究中心，安徽省农产品加工重点实验室

摘要

咸鸭蛋蛋白是咸鸭蛋工业加工过程中产生的富含蛋白质的副产品，通常被作为废弃物丢弃，这既造成环境污染也带来经济损失。本研究开发了一种优化的电膜过滤（EMF）工艺，用于高效回收这种高盐含量副产品中的溶菌酶。在最佳条件下——进料稀释比为1:1.5（体积比），电流密度为400 mA，使用均匀的离子交换膜，并经过360分钟的处理时间——溶菌酶的回收率达到了48.9%。回收的溶菌酶（EMF-LYS）具有较高的纯度和结构完整性，其二级和三级结构得到保留，构象稳定性得到增强，热力学性质也显著改善，优于商业标准品（IEP-LYS）。尽管EMF-LYS的变性温度略有降低（71.59 °C对比IEP-LYS的73.08 °C），但其焓变（ΔH）显著增加（791.0 J/g对比503.6 J/g），表明尽管热稳定性稍低，但其构象更为稳定。此外，EMF-LYS仍保持了对金黄色葡萄球菌的强大抗菌活性，证实了其生物功能的保留。这些结果证明了EMF是一种高效且可持续的策略，可用于高盐含量蛋白质副产品的价值转化，在食品和制药行业具有广泛的应用潜力。

引言

咸鸭蛋是一种传统的腌制食品，通过长时间浸泡新鲜鸭蛋制成。在中国，每年有数十亿个咸鸭蛋黄被用于月饼和烘焙食品等传统产品中。咸鸭蛋的工业加工主要针对蛋黄进行，每年产生约10,000吨剩余的咸鸭蛋蛋白（Panpipat & Chaijan, 2020）。这种副产品富含蛋白质（包括卵清蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白和卵粘蛋白），由于其均衡的氨基酸组成、维生素和微量元素，仍具有相当高的营养价值（Campbell et al., 2003）。然而，由于脱盐成本高昂，咸鸭蛋蛋白常常被作为废弃物丢弃，导致资源浪费和环境污染（Yao et al., 2022a）。因此，开发高效利用这种富含蛋白质的资源的方法已成为亟待研究的重点。

溶菌酶（LYS）占鸭蛋蛋白蛋白质的3.4%，分子量为14.3 kDa（Iwashita et al., 2017），是一种具有抗菌（Khorshidian et al., 2022）、抗炎（Tagashira et al., 2018）和抗病毒（Bergamo & Sava, 2024）特性的关键生物活性成分。它被广泛应用于制药、食品保存和生物技术领域。目前的溶菌酶工业生产主要依赖色谱技术，包括离子交换、亲和层析和吸附层析（Chang et al., 2021, Tankrathok et al., 2009）。尽管这些方法有效，但它们往往受到操作复杂性高、处理时间长和耗材成本高的限制。相比之下，等电沉淀等基于电荷分离的方法产量和纯度较低（Yao et al., 2022b）。虽然新鲜鸭蛋蛋白是溶菌酶的优质来源，但其高效加工技术已经成熟。然而，咸鸭蛋蛋白的高盐含量（约8%–12%（重量百分比NaCl）对传统的纯化技术（如离子交换层析）构成了挑战，通常需要昂贵的脱盐步骤。因此，需要更高效且经济可行的技术——特别是那些能够耐受高盐环境的技术——来从咸鸭蛋蛋白中回收溶菌酶并减少工业废弃物。

电膜过滤（EMF），也称为电渗析-超滤（EDUF），是一种结合了膜过滤和电泳原理的新兴分离技术。在典型的EMF系统中，施加的电场驱动带电分子通过离子交换膜和超滤膜的堆叠层进行电泳迁移（Cerrillo-Gonzalez et al., 2023）。这种配置能够同时基于分子电荷（通过电泳）和大小（通过膜选择性）进行分离，特别适用于复杂混合物的处理。操作上，进料液和接收液在系统的不同腔室中循环，从而实现目标化合物的连续或批量回收。EMF已成功应用于多种场景，包括蛋白质混合物的分离（例如BSA和溶菌酶）（Chen et al., 2015）、工业废水处理（Lafi et al., 2018）以及从食品蛋白水解物中分离生物活性肽（Dlask & Václavíková, 2017），显示出其在复杂基质中分离生物分子方面的多功能性。EMF的一个显著优势在于能够分离分子量相近的蛋白质——这对传统超滤技术来说是一个挑战。溶菌酶具有较低的分子量（14.3 kDa）和较高的等电点（pI ≈ 10.5），与其他主要蛋清蛋白（如卵清蛋白，pI ≈ 4.7）形成鲜明对比（Li et al., 2020）。这种物理化学性质的显著差异使得溶菌酶成为基于EMF分离的理想目标，其中施加的电场驱动带电溶菌酶通过超滤膜选择性迁移，而较大或电荷相反的杂质则因尺寸排阻和静电排斥作用而被阻挡。

虽然传统的等电沉淀、超滤和离子交换层析等方法已被广泛用于溶菌酶的分离，但它们往往存在产量低、操作成本高和可能的结构变性等问题。特别是从咸鸭蛋蛋白中提取溶菌酶时，等电沉淀的回收率通常低于30%，且纯度受其他蛋白质共沉淀的影响而降低。相比之下，EMF结合了基于电荷和大小的选择性，特别适用于高盐环境。本研究设计并优化了一种从咸鸭蛋蛋白中回收溶菌酶的EMF工艺，这一需求源于解决咸鸭蛋黄加工过程中产生的废弃物的紧迫性。系统评估了关键的操作参数（包括进料液稀释比、施加电流密度、处理时间和膜类型），以提高回收效率。此外，还详细分析了纯化溶菌酶的结构完整性、热稳定性和抗菌活性，以评估其工业应用的适用性。本研究不仅建立了优化的EMF工艺流程，还与传统方法在回收效率、产品纯度和结构完整性方面进行了直接比较，突显了其作为溶菌酶价值转化的可持续和高效替代方案的潜力。

材料

氯化钠（NaCl，≥99.8%）、无水硫酸钠（Na?SO?，≥99.0%）、氢氧化钠（NaOH，≥96.0%）和盐酸（HCl，36%–38%）购自中国上海的中国医药化学试剂有限公司。溶菌酶（IEP-LYS，商业级，通过离子交换层析提取，分子量14.4 kDa，≥20,000 U/mg）购自中国北京的Solarbio科技有限公司。咸鸭蛋蛋白（pH 8.2 ± 0.3，总蛋白含量9.2 ± 0.5 g/100 g湿重，盐含量……）

预处理进料液的物理化学性质

尽管通过离心去除了黏蛋白，原始咸鸭蛋蛋白仍保持较高的蛋白质浓度。由于进料浓度是影响电膜工艺性能的关键参数（Sadrzadeh & Mohammadi, 2008），因此对用2%硫酸钠溶液按1:1、1:1.5和1:2（体积比）稀释后的蛋白液的物理化学性质进行了表征（图2）。

如表1所示，稀释显著改变了溶液的比色性质……

结论与展望

本研究证明了电膜过滤（EMF）是一种高效且可持续的方法，可用于从食品加工产生的高盐副产品咸鸭蛋蛋白中回收生物活性溶菌酶。在最佳条件下（进料稀释比为1:1.5，电流密度为400 mA，使用均匀的膜，处理时间为360分钟），溶菌酶的回收率为48.90%。所得的EMF-LYS具有与商业溶菌酶标准相当的高纯度和结构完整性……

CRediT作者贡献声明

瓦利德·埃尔法莱（Walid Elfalleh）：撰写、审阅与编辑。 叶永康（Yongkang Ye）：验证、实验研究。 肖冉（Ran Xiao）：监督、资源协调。 牛天娇（Tianjiao Niu）：监督、资源协调。 孙汉柱（Hanju Sun）：监督、项目管理、资金获取。 邱敏秋（Min Qiu）：撰写初稿、验证、实验研究、数据分析。 何淑东（Shudong He）：撰写、审阅与编辑、撰写初稿、监督、项目管理、方法学设计、资金获取、概念构思。 金彤（Tong Jin）：实验研究、数据分析。

未引用参考文献

Ali and Al-Lohedan, 2020.

数据可用性

数据可根据合理请求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者衷心感谢合肥工业大学化学与工程学院张旭教授的研究团队提供的必要实验设备和基础设施。厦门肯宁水处理有限公司的技术支持对本文的方法开发起到了重要作用。此外，本研究中使用的均匀离子交换膜（TRJCM-I）由北京婷润公司慷慨提供。