RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡通过饮用水在慢性砷暴露中促进肝脏炎症

《Food and Chemical Toxicology》：RIPK3/MLKL-Mediated Necroptosis Promotes Hepatic Inflammation in Chronic Arsenic Exposure through Drinking Water

慢性砷暴露通过RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡导致小鼠肝损伤，基因敲除MLKL可减轻炎症和肝细胞坏死，提示靶向MLKL可能为治疗砷性肝损伤提供新策略。

　　

张萌|贾明照|刘一楠|史亚文|赵旭|陈晨|陈敬宏

西安交通大学公共卫生学院、健康科学中心，国家卫生健康委员会环境与地方病重点实验室，中国陕西省西安市雁塔西路76号，710061

摘要

长期暴露于含砷的饮用水是导致肝脏损伤的主要环境风险因素，但其致病机制仍不清楚。本研究利用慢性体内小鼠模型探讨了RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡在砷诱导的肝毒性中的作用。小鼠在饮用水中分别以2.8、8.4和25.2毫克/升的浓度暴露于亚砷酸钠（NaAsO₂）8周。砷暴露引起了剂量依赖性的肝细胞坏死、肝脏损伤标志物（ALT、AST、GST-α、GDH）升高，以及p-RIPK3、p-MLKL和HMGB1在肝脏中的表达增加，同时促炎细胞因子TNF-α和IL-6也上调。值得注意的是，在高剂量砷暴露（25.2毫克/升）后，Mlkl^-/-小鼠的肝脏损伤显著减轻，ALT、AST、GSHα和GDH的水平降低，HMGB1、TNF-α和IL-6的表达也减少。这些发现表明，RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡通过促进肝细胞死亡和炎症参与了砷诱导的肝脏损伤。抑制MLKL可以通过减少小鼠的细胞死亡和炎症来缓解砷诱导的肝脏损伤。针对MLKL可能为减轻慢性砷相关肝毒性提供一种有前景的治疗策略。

引言

长期接触砷这种普遍存在的环境毒素仍然是重大的公共卫生问题。全球有超过1.4亿人受到地下水砷污染的影响，主要通过饮用含砷的饮用水（Podgorski和Berg，2020）。在孟加拉国、印度和中国部分地区，地下水中砷的浓度经常超过100微克/升，远超世界卫生组织（WHO）推荐的10微克/升的限制（Rehman等人，2021；Rodríguez-Lado等人，2013）。此外，气候变化和不可持续的土地利用方式正在加速砷从沉积物中进入地下水系统（Li等人，2021；Sevak和Pushkar，2024）。

长期摄入含砷的水与多种不良健康效应密切相关，包括肝毒性、心血管疾病、神经发育缺陷和多种癌症（El-Ghiaty和El-Kadi，2023）。肝脏作为砷代谢和生物转化的靶器官，特别容易受到影响。研究一致表明，长期摄入砷与严重的肝脏病理变化有关，主要表现为肝细胞死亡和炎症浸润、进行性纤维化以及肝细胞癌的风险增加（Deng等人，2024；Lai等人，2024；Yang等人，2023）。然而，尽管进行了大量研究，砷诱导的肝脏损伤的分子机制仍不完全清楚，这限制了有效干预措施的发展。

肝细胞死亡是导致慢性肝病的关键致病机制，会引起组织进行性重塑、炎症和纤维化（Schwabe和Luedde，2018）。虽然氧化应激和凋亡长期以来被认为与砷诱导的肝脏损伤有关（Jomova等人，2011），但最近的研究表明，这些机制可能无法完全解释观察到的肝毒性。药物抑制凋亡只能部分缓解砷诱导的肝脏损伤（Choudhury等人，2016），这表明在砷引起的肝脏损伤过程中存在另一种细胞死亡机制。

坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡途径，已被证实是肝脏病理的主要贡献者。它由受体相互作用蛋白激酶RIPK1和RIPK3调控，并由混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）执行（Bertheloot等人，2021；Vucur等人，2023）。激活后，MLKL寡聚化并破坏细胞膜完整性，释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活炎症信号通路（Frank和Vince，2019）。坏死性凋亡已被证实参与了多种慢性肝病的发病机制，包括酒精性和非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎和肝细胞癌（Vucur等人，2023；Ye等人，2023）。MLKL缺乏或药物抑制已在多个实验模型中显示出可以减轻肝细胞坏死、免疫激活和肝脏纤维化（Guo等人，2022；Majdi等人，2020）。然而，尚不清楚RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡是否在长期摄入含砷饮用水等环境相关暴露情况下在砷诱导的肝脏损伤中起因果作用。

因此，我们使用野生型和Mlkl^-/-小鼠建立了慢性砷暴露的体内模型，以确定坏死性凋亡在砷诱导的肝脏损伤中的作用。本研究旨在阐明MLKL介导的坏死性凋亡是否导致砷相关的肝细胞死亡和炎症，并评估针对MLKL作为治疗环境性肝脏损伤策略的潜力。

实验部分

生成Mlkl敲除小鼠

使用CRISPR-Cas9技术（Cyagen Biosciences Inc.，中国）生成了Mlkl^-/-小鼠。将靶向外显子3的单一引导RNA（sgRNA）微注射到C57BL/6N受精卵中，产生F0代嵌合体。实验中使用的同窝小鼠来自杂合子交配。在出生后7至12天内采集尾部组织样本，通过PCR进行遗传鉴定。3周大的雄性小鼠用于后续实验。所有动物实验均符合

通过饮用水长期暴露于砷会导致小鼠出现肝脏组织学损伤

小鼠通过饮用水以低（2.8毫克/升）、中（8.4毫克/升）或高（25.2毫克/升）浓度暴露于亚砷酸钠（NaAsO₂）8周。检测到血液中砷含量显著且与剂量相关地增加，而各实验组之间的平均饮水量或肝脏指数没有明显变化（图1a）。组织病理学分析显示，所有砷暴露组均出现了进行性的肝脏损伤。在低剂量砷组中，观察到轻微的炎症细胞浸润

讨论

长期接触含砷的饮用水仍然是一个紧迫的全球健康问题，导致以肝细胞死亡、炎症和组织进行性重塑为特征的肝脏疾病负担。尽管砷诱导的肝毒性已被归因于氧化应激和凋亡（Khan等人，2022；Wen等人，2025），但其复杂的致病机制仍需进一步研究。本研究表明，通过RIPK3/MLKL信号通路介导的坏死性凋亡在砷诱导的肝毒性中起着重要作用

结论

我们的研究结果表明，RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡是砷诱导的肝细胞损伤和炎症的关键因素。抑制或基因删除MLKL显著减轻了肝脏损伤，突显了坏死性凋亡作为潜在治疗靶点的作用。本研究提供了对砷诱导的肝毒性的机制见解，并有助于更广泛地理解环境毒理学中的细胞死亡途径。

伦理批准

所有动物实验均符合ARRIVE指南，并按照国家研究委员会关于实验室动物护理和使用的指南进行。伦理批准由西安交通大学医学院动物伦理委员会授予（批准编号：XJTUAE2023-163）。

CRediT作者贡献声明

张萌：撰写——原始草案、研究、资金获取、概念构思。陈敬宏：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。陈晨：撰写——审稿与编辑、监督。刘一楠：撰写——审稿与编辑、方法学。贾明照：方法学、研究、数据分析、数据管理。赵旭：研究。史亚文：撰写——审稿与编辑

数据可用性声明

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资助声明

本工作得到了陕西省自然科学基础研究计划（资助编号：2024JC-YBQN-0859）、中央高校基本科研业务费（资助编号：xzy012022125；xzy012025153）、陕西省博士后科学基金（资助编号：31271000000017）以及国家自然科学基金（资助编号：82473748）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢中央高校基本科研业务费（资助编号：xzy012022125；xzy012025153）、陕西省自然科学基础研究计划（资助编号：2024JC-YBQN-0859）和陕西省博士后科学基金（资助编号：31271000000017以及国家自然科学基金（资助编号：82473748的支持。图形摘要的制作使用了FigDraw 2.0软件。我们感谢张增铁（西安）的帮助