用于多种食品基质中检测大豆过敏原的ELISA试剂盒的比较

《Food Control》：Comparison of allergen ELISA kits for soy detection in multiple food matrices

大豆过敏检测中七种商业ELISA试剂盒在不同九类食品基质中的性能比较。结果显示所有试剂盒均能定性检测0.5mg/kg大豆蛋白（ED01），但定量回收率因试剂盒和基质差异显著，肉类替代品基质中仅3种试剂盒达标，为食品行业选择合适检测方法提供依据。

　　

Nathalie G.E. Smits|Elike Treffers|Bart van der Nagel|H.J. Van Der Fels-Klerx|Marleen Voorhuijzen|Elise F. Hoek-van den Hil

瓦赫宁根食品安全研究，瓦赫宁根大学及研究中心，邮政信箱230，6700 AE瓦赫宁根，荷兰

摘要

大豆被广泛用作食品中的蛋白质来源，但即使微量也可能在过敏人群中引发有害反应。为了降低安全风险，食品生产商可以使用市售的ELISA试剂盒来检测大豆的意外存在。然而，由于关于不同基质上检测性能的信息有限，选择合适的ELISA试剂盒颇具挑战性。因此，本研究比较了七种市售的大豆ELISA试剂盒在九种不同食品基质上的检测效果：饼干、巧克力、饮料、零食、植物基饮料和产品、乳制品、冰淇淋、肉类替代品以及香草/香料。大豆含量以每千克食品中总大豆蛋白的毫克数来表示，包括添加了大豆的样品和自然含有大豆的样品。评估了添加样品的回收率、实验内和实验间的变异性。所有试剂盒都能在每种基质的相关消费量下，定性检测到0.5毫克总大豆蛋白的引发剂量（ED01）。从定量角度来看，检测到的大豆浓度随着大豆含量的增加而增加，但不同试剂盒和基质之间的回收率存在差异。符合回收率标准的试剂盒数量如下：乳制品（7种）、饼干（6种）、冰淇淋（6种）、植物基饮料和产品（6种）、零食（5种）、饮料（5种）、香草/香料（5种）、巧克力（4种）以及肉类替代品（3种）。肉类替代品是最具挑战性的基质，只有三种试剂盒符合标准。这些发现为市售大豆ELISA试剂盒提供了性能对比数据，有助于食品行业选择合适的方法来可靠地检测特定基质中的大豆，从而改善过敏原风险管理和消费者安全。

引言

大豆（Glycine max）被广泛用作食品中的蛋白质来源（Wiederstein等人，2023年）。大豆蛋白的氨基酸组成非常均衡（Tessari等人，2016年）；然而，它们也已知会引发免疫介导的食品过敏（Muthukumar等人，2020年）。在食品中，大豆可以作为纯成分使用，例如作为豆类、豆腐或天贝，也可以通过加工利用其功能性，如乳化、发泡、凝胶化以及吸收水分和脂肪（Ashaolu，2020年；L'Hocine & Boye，2007年）。这些基于大豆的产品的制备需要加工。已知某些加工步骤会影响产品的致敏性（Pi等人，2021年）。热处理可以通过掩盖或破坏表位来降低致敏性；然而，它也可能通过暴露或形成新的表位来增加致敏性。发酵可以减少83.8%-94.8%的致敏性（Rui等人，2019年）。

由于大豆在食品中的多种用途，其占全球蛋白质总摄入量的比例高达67%（L'Hocine & Boye，2007年）。这种在食品生产中的广泛使用对大豆过敏患者来说是一个挑战，因为避免食用大豆是唯一有效的治疗方法（Wang等人，2022年）。据估计，普通人群中大豆过敏的比例在0.3%到3%之间（Wiederstein等人，2023年）。预计在0.5毫克（ED01）的引发剂量下，1%的大豆过敏消费者会出现过敏症状。这一剂量是根据Houben等人（2020年）描述的“无不良效应水平（NOAEL）”和“最低观察到的不良效应水平（LOAEL）”以及统计建模确定的。

为了向过敏消费者提供食品成分信息，欧盟法规1169/2011（“欧盟法规1169/2011”，2011年）规定了必须标注14种指定过敏原成分，并且这些成分的字体格式与其他成分列表不同。然而，由于交叉接触等原因，大豆也可能意外存在于食品中。在可能发生交叉接触的情况下，行业通常会使用预防性过敏原标签（PAL）来警告过敏患者；然而，这在一些国家并未受到监管。随着FAO/WHO最近发布了一系列关于PAL使用的报告和建议（FAO/WHO，2022a、2022b、2023a、2023b；2024a），相关法规正在逐步完善。此外，许多行业非常重视PAL标签的使用；然而，这往往缺乏依据，导致“过度标注”，从而减少了过敏患者的食品选择（Reese等人，2015年）。为了实现基于证据的预防性标签，需要统一行动水平（产品中的安全浓度），这反过来又需要灵敏且稳健的分析方法来检测所有不同类型基质中可能存在的大豆。

大豆的意外存在可以通过ELISA、qPCR和MS方法检测到。这些方法的性能取决于食品基质的类型和加工方式。大豆的加工可能会影响大豆蛋白的检测（Holzhauser等人，2020年）。对于食品工业以及商业和官方控制实验室来说，市售的qPCR和ELISA试剂盒通常是首选方法，因为它们成本相对较低、周转时间快，并且由受过培训的实验室人员易于操作。然而，测量对象的标准化程度不足，这影响了不同市售ELISA试剂盒结果的可比性，从而给风险评估人员带来了解释上的困难。此外，市售ELISA试剂盒通常针对特定基质进行了验证，而这些基质并不总是适用于需要检测大豆的基质。因此，本研究重点比较了不同类型食品基质和不同加工食品中市售ELISA试剂盒的检测效果。通过统一测量对象，可以突出这项技术的优势和劣势，并评估不同市售ELISA试剂盒在检测大豆方面的相似性和差异。

材料

本研究比较了以下ELISA试剂盒：用于过敏原检测的大豆粉3234（NIST，MD，美国）、3M?大豆蛋白ELISA试剂盒（E96SOY，3M，MN，美国）、MonoTrace大豆ELISA（SG6-EK-96，Biofront，FL，美国）、Morinaga日本大豆ELISA试剂盒II、Veratox?大豆试剂盒（8410，Neogen英国）、AgraQuant?大豆ELISA测试试剂盒（COKAL0448，Romer，奥地利）、Ridascreen?快速大豆试剂盒（R7102，R-Biopharm，德国）、Soy（ESSOYPRD-48，Elisa Systems，澳大利亚）。

每种基质组包括：饼干、巧克力、饮料、乳制品

大豆检测试剂盒的比较

空白样品和添加了大豆的样品使用7种ELISA试剂盒进行了检测，结果如图2和补充表S3所示。正如预期的那样，所有试剂盒在所有基质中都观察到随着大豆添加量的增加而信号增强。不过有一个例外，R-Biopharm试剂盒在肉类/肉类替代品基质中，在所有添加水平下都显示出了高于检测上限的信号。

试剂盒的性能

表3显示了7种ELISA试剂盒在添加了大豆的基质中的回收率结果。

试剂盒的性能

高消费量的食品会导致较低的行动水平，因为更多的消费者会摄入更高剂量的大豆。较低的行动水平要求检测试剂盒具有更高的灵敏度。然而，基质效应可能会影响过敏原的回收，导致无法检测到低水平的大豆。在我们的研究中，饮料就是这种情况，某些试剂盒的回收率受到了基质效应的影响。

所有试剂盒都能在最近的大豆添加水平下定性检测到大豆

结论

评估了七种不同ELISA试剂盒在九种不同基质中检测大豆的效果。所有七种试剂盒都能定性检测到大豆的存在。此外，在自然含有大豆的样品中，当大豆浓度较高时，通常会得到高于ULOQ的阳性结果，只有一个零食样品是个例外。当大豆含量较低时，结果的变化较大。当大豆含量高于检测限（LOD）时，ELISA试剂盒能够检测到大豆的存在。总体而言，

作者贡献声明

Elise F. Hoek-van den Hil：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Marleen Voorhuijzen：撰写——审阅与编辑、监督、数据管理、概念构思。H.J. Van Der Fels-Klerx：撰写——审阅与编辑。Bart van der Nagel：撰写——审阅与编辑、监督、概念构思。Elike Treffers：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、监督、数据管理。Nathalie Gabrielle Esther Smits：撰写

未引用的参考文献

《食品过敏原免疫测定验证指南》等，2023年；ISO 13528，2015年；欧盟法规1169/2011，2011年；USDA，2023年；FAO/WHO，2022a；FAO/WHO，2023a；FAO/WHO，2023b。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

该项目得到了农业部、渔业、食品安全和自然（通过荷兰Top sector Agri&Food项目LWV19252以及部分KB-37-002-038）的财政支持。我们想感谢我们的合作伙伴：3M、Allergenen Consultancy、Biofront technologies、Danone、Generon、Mérieux NutriSciences、Morinaga、Neogen、Nutrilab、Progenus、Romer和Unilever，他们对实验概念和研究提供了支持，并提供了空白样品材料和测试试剂盒。我们还要