《Future Foods》：Inside Out–A Sustainable Strategy Harnessing Smear Bacteria for Accelerating Cheese Ripening
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本研究为加速涂抹成熟奶酪（如Danbo、Limburger等）的熟化过程，提出了一种创新策略。传统的表面涂抹熟化通常需要4-8周，耗时长且成本高。研究人员针对性地选用了从丹麦Danbo奶酪中分离出的具有高蛋白水解活性的Brevibacterium linens MA5菌株，通过将其发酵乳直接添加到用于制作凝乳的原料乳中，并在奶酪成型后用NaHCO?溶液处理提升表面pH，成功在短短一周内建立致密菌群，显著加快了内部游离氨基酸的积累和外部菌群的生长。这种方法不仅省去了反复涂抹的工序，还能通过提供肽和氨基酸促进蛋白酶阴性乳酸乳球菌的生长，从而可能减少因蛋白质水解产生苦味肽带来的问题，为降低奶酪生产成本和能耗、提高生产效率提供了一种可持续方案。
在许多人的餐桌上，涂抹成熟的奶酪以其浓郁独特的风味占据着一席之地。这类奶酪，如Danbo、Limburger、Tilsit和Munster，其标志性的红色-橙色外皮和强烈风味，来自于表面生长的耐盐好氧细菌，如葡萄球菌、微球菌、棒状杆菌以及短杆菌等。然而，美味的代价不菲。传统的表面涂抹成熟过程漫长，通常需要4到8周才能让表面菌群充分生长，形成稳定的“涂抹层”。这个过程不仅需要特殊的温湿度控制设施，长时间储存也带来了高昂的库存成本和微生物污染（如霉菌和Listeria）的风险。因此，奶酪行业亟需一种更高效、可持续的策略来缩短熟化时间，降低成本与风险。
在这一背景下，来自丹麦技术大学国家食品研究所的赵双青、Belay Tilahun Tadesse、顾柳燕和Christian Solem团队在《Future Foods》上发表了一项创新研究。他们聪明地想到：既然涂抹细菌生长缓慢的主要瓶颈在于其在奶酪外皮上的定植和增殖速度，那么能否让这些细菌“从内到外”地为熟化做贡献呢？这项研究正是为了探索这种可能性，并开发一种无需反复涂抹、能显著加速熟化过程的新方法。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们从丹麦本地涂抹成熟奶酪中分离并筛选了37株表面细菌，通过azocasein法测定其发酵乳中的蛋白水解活性。其次，利用连续监测pH的iCinac系统，评估了不同涂抹细菌发酵培养物对蛋白酶阴性乳酸乳球菌EC2菌株在牛奶中酸化行为的促进作用。接着，他们通过实验室规模的奶酪制作试验，比较了不同添加量的候选菌株发酵乳对奶酪内部游离氨基酸积累的影响。最后，运用全基因组测序、组装与生物信息学分析（包括ANI、dDDH、系统发育树构建以及次级代谢产物基因簇挖掘），对筛选出的关键菌株进行了全面的遗传学与安全性评估。
筛选具有高蛋白水解活性的涂抹细菌
研究人员首先从37株分离株中筛选蛋白水解活性高的菌株。结果显示，不同菌株的活性差异很大，从可忽略的水平到超过3.9 ACU/min。其中，从丹麦Danbo奶酪中分离得到的Brevibacterium linensMA5（MA5）和Microbacterium gubbeenenseRA16表现出最高的活性，MA5的活性达到约3.91 ACU/min，显著高于大多数其他分离株。基于此，研究人员选择了包括高活性菌株（MA5和RA16）、中等活性菌株（如RA8、T1C1、HA13）和低活性菌株（RA15和T3B2）在内的八株代表性菌株进行后续实验。
涂抹细菌释放的氨基酸和肽能促进蛋白酶阴性乳酸乳球菌菌株的生长
接下来，研究人员测试了这些涂抹细菌的发酵培养物是否能促进蛋白酶阴性乳酸乳球菌EC2的生长（通过酸化曲线反映）。结果发现，在所测试的菌株中，只有B. linensMA5能够显著促进EC2的酸化，其酸化速度几乎与EC2的衍生母株——蛋白酶阳性的RD07菌株相当。值得注意的是，即使是在添加了0.01%酪蛋白胨（常用于支持蛋白酶阴性菌生长的补充物）的牛奶中，EC2的酸化速度也比RD07慢。有趣的是，虽然RA16的蛋白水解活性与MA5相似，但对EC2生长/酸化的促进程度却远不如MA5，这可能是因为其产生的蛋白酶类型不同，生成的肽不能被EC2同等程度地利用。
Brevibacterium linens MA5能独特地促进蛋白酶阴性乳酸乳球菌EC2的生长
为了确认MA5的特异性，研究人员将其与两种商业化的B. linens菌株（CLO和Linens W）进行了比较。无论是否将发酵培养物的pH调整至6.5，MA5发酵乳都能最有效地促进EC2的酸化，其体系pH在10小时内降至4.5以下，酸化速度更快、程度更深。相比之下，CLO和Linens W的促进作用较弱。这表明MA5的促进作用主要归功于其强大的胞外蛋白水解活性，而非简单的pH缓冲作用。
仅需3%的MA5培养物即可强烈刺激蛋白酶阴性乳酸乳球菌
考虑到大规模培养涂抹细菌用于奶酪生产的实际挑战，研究人员测试了不同添加量（0.5%到20%，v/v）的MA5发酵乳对EC2酸化的影响。结果显示，增加MA5的添加量总体上能增强EC2的酸化能力，但促进作用并非线性增加。引人注目的是，添加3% MA5时酸化最为迅速，能在10小时内达到最低的最终pH（约4.4）。过低（0.5%，1%）或过高（20%）的添加量促进作用反而减弱。过低可能无法提供足够的肽或酶，而过量可能导致氨、甲硫醇等代谢副产物积累，抑制EC2的生长。
MA5是B. linens物种的边缘成员，具有抗菌活性
对MA5进行全基因组测序和分析发现，其基因组大小为3,717,937 bp。基因组相似性分析（dDDH值70.8%， ANI值93.99%）支持其归属于B. linens物种，尽管处于物种定义的边缘。系统发育树分析也将其与B. linensATCC 19391等参考菌株归为一簇。安全性评估表明其基因组中不含有毒力或抗生素抗性基因。此外，基因组挖掘发现MA5含有一个推测的Linocin M18基因簇，这是一种III类细菌素，已知能抑制单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等有害微生物的生长。
实验室奶酪试验表明MA5可以加速奶酪熟化
实验室制作的奶酪模型显示，与仅使用EC2制作的对照奶酪相比，所有奶酪在熟化3周后游离氨基酸含量均显著增加。添加MA5发酵乳明显增强了蛋白质水解作用，证实了其能弥补EC2缺乏细胞包膜蛋白酶（CEP）的不足。在第3周时，添加10% MA5+EC2的奶酪达到了最高的总游离氨基酸含量（约65 mg/g），添加3% MA5+EC2的紧随其后，两者均显著高于添加1% MA5+EC2的奶酪。而单独添加MA5（不添加EC2）的奶酪，其游离氨基酸积累量较低，凸显了主要发酵剂（EC2）的重要贡献。结果表明，添加3%或10%的MA5培养物都有助于支持高效的奶酪熟化，其中3%的添加量在工业规模上可能更具实用性。
无需涂抹——将MA5培养物加入原料乳即可省去涂抹工序
传统的涂抹成熟奶酪生产需要在盐渍后将涂抹培养物施用于奶酪表面，有时需重复多次。本研究开发了一种简化方法：在奶酪制造过程中直接将B. linensMA5掺入凝乳，从而省去反复的表面涂抹。为了促进MA5在外皮上的生长，将新鲜的盐渍奶酪浸泡在10% NaHCO3（碳酸氢钠）溶液中（将奶酪表面pH提升至~6.5）或进行常规处理（pH ~5.2），未处理的奶酪（pH ~5.1）作为对照。结果显示，只有经碳酸氢钠处理的奶酪在7天内出现了清晰的橙色色素沉着和致密的菌群生长（MA5生长）。相比之下，常规处理和未处理的奶酪仍呈苍白，未见MA5明显生长。在丹麦一家奶酪工厂对大型Danbo型奶酪进行的扩大试验也证实，采用新型碳酸氢盐盐渍方法（如T2、T3、T4处理）的奶酪在仅8天内就实现了MA5的快速表面定植和致密涂抹层的形成，与需要4周的传统反向接种法（T5）相比，有效防止了腐败真菌的生长，并将总体奶酪熟化时间缩短了至少3周。加速熟化并未影响奶酪的最终风味，与传统方法生产的参考奶酪相当。
结论与讨论
这项研究展示了一种克服涂抹成熟奶酪长熟化时间的新颖策略。通过将B. linensMA5的发酵乳直接加入原料乳，研究人员实现了无需传统表面涂抹的内部与外部双重熟化。MA5表现出卓越的蛋白水解活性，其释放的肽和游离氨基酸有效支持了蛋白酶阴性乳酸乳球菌EC2的生长。这种方法不仅加速了奶酪内部风味前体物质的积累，当与碳酸氢盐盐渍结合时，还能在一周内促进有效的外皮定植和由外及内的熟化过程。研究结果强调了提升外皮pH对于促进B. linens生长的重要性，酸性环境（~pH 5.1）会抑制MA5及其他涂抹微生物的生长，从而也绕过了对耐酸酵母的需求。
该策略的意义在于提供了一种可持续的奶酪熟化创新方案。它能够减少资源消耗和熟化时间，降低对产生苦味肽的蛋白水解型发酵剂菌株的依赖，同时保持涂抹成熟奶酪的感官品质，并具备明显的大规模应用潜力。当然，将MA5整合到奶酪中的感官影响、在工业规模上培养和应用该菌株的可行性，以及熟化参数（如温度、湿度和碳酸氢盐处理时长）的微调，仍需行业进一步考虑和优化。本研究为此提供了重要的灵感和科学依据。
