Sibakazin：一种新型黑蝇来源的非经典kazal蛋白酶抑制剂，能够靶向抗血小板（P2Y12/GPVI）通路，同时不会干扰血液凝固过程

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Sibakazin: a novel black fly derived non-classical kazal protease inhibitor, targeting antiplatelet (P2Y12/GPVI) pathways without perturbing coagulation

本研究从云南库蚊唾液腺中鉴定出一种新型单域Kazal型抑制剂Sibakazin，其独特的酸性N端和P1位甲硫氨酸使其不抑制凝血酶原时间，但在小鼠体内显著抑制FeCl3诱导的动脉血栓和羧甲基纤维素诱导的静脉血栓，同时不增加出血风险。机制研究表明，Sibakazin通过直接抑制GPVI和ADP受体P2Y12双重阻断血小板活化信号通路，抑制血小板聚集、扩散和血栓收缩。

　　

李卓睿|何彦梅|沈燕|何淼|林婷|杨嘉怡|穆立贤|吴静|杨海龙

昆明医科大学基础医学科学院，中国云南省昆明市650500

摘要

虽然吸血动物的Kazal型抑制剂是众所周知的抗凝剂，但它们在血小板调节中的作用仍大部分未得到探索。在这里，我们报道了从吸血黑蝇Simulium bannaense的唾液腺中分离出的一种单结构域Kazal型抑制剂Sibakazin的特性。结构上，Sibakazin具有非典型的酸性N端和位于P1位点的甲硫氨酸。与这种独特结构一致，Sibakazin对凝血级联反应中的关键丝氨酸蛋白酶（如凝血酶、FXa）没有活性，也不影响凝血时间（aPTT、PT），这使其与传统的抗凝剂不同。有趣的是，Sibakazin在体内表现出强大的抗血栓效果，能够抑制FeCl₃诱导的动脉血栓和卡拉胶诱导的静脉血栓，同时不增加出血风险。机制上，Sibakazin通过双重抑制血小板活化发挥作用：它直接靶向糖蛋白VI（GPVI），抑制下游的Src/Syk/PLCγ2/Akt信号通路以阻止血栓形成；同时抑制ADP受体P2Y12，破坏PI3K/Akt通路以减弱二次放大信号。这种双重阻断有效地抑制了血小板聚集、扩散和血栓收缩。我们的发现表明Sibakazin是一种新型的双靶点抗血小板药物，具有强大的安全抗血栓特性，扩展了Kazal型抑制剂的功能范围，并为下一代治疗药物的开发提供了有希望的贡献。

引言

血栓栓塞性事件是全球发病率和死亡率的主要原因之一。因此，开发创新的抗血栓策略，特别是新的抗血小板药物和抗凝剂，对于改善患者预后至关重要（Gross和Weitz，2009）。吸血动物进化出了多种唾液生物活性成分，以解除宿主的止血反应，从而便于获取血液。丝氨酸蛋白酶抑制剂，如Kazal家族抑制剂，是吸血动物唾液腺的重要组成部分。这些抑制剂作为抗血栓药物具有显著的潜力（Chagas等人，2014）。例如，从Hirudo medicinalis中分离出的水蛭素因其特有的酸性C端延伸而具有卓越的凝血酶抑制活性。其衍生物如bivalirudin、lepirudin和desirudin已在临床中有效用于治疗深静脉血栓形成、急性冠状动脉疾病和其他血栓性疾病（Liu等人，2024；Xu等人，2020）。因此，从吸血动物中鉴定和表征丝氨酸蛋白酶抑制剂是发现新的抗血栓剂的有效方法。

Kazal型蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的重要成员，由一个或多个Kazal结构域连接而成。Kazal结构域的结构完整性依赖于六个保守的半胱氨酸残基，这些残基形成了三个关键的域内二硫键，连接位置1-5、2-4和3-6。这些二硫键对于维持该结构域的特征三维结构至关重要（Rimphanitchayakit和Tassanakajon，2010）。Kazal型抑制剂广泛分布于多种动物物种中，如节肢动物（例如，Aedes aegypti）（Walvekar等人，2022；Watanabe等人，2010a）、软体动物（例如，Cenchritis muricatus）（Rojas等人，2021）和环节动物（例如，Hirudo nipponia）（Kim等人，2001）。这些抑制剂的P₁位点主要由Arg或Lys残基占据，这赋予了它们对丝氨酸蛋白酶（如弹性蛋白酶和纤溶酶）的选择性（Rimphanitchayakit和Tassanakajon，2010）。黑蝇（双翅目：Simuliidae）是高效的病原体载体，需要脊椎动物的血液来促进卵的发育（Smith等人，2022；Tsujimoto等人，2012）。在整个吸血过程中，唾液分泌物被输送到进食部位，其中含有增强血液获取效率的抗止血因子。这些生物活性分子通过抑制凝血级联激活、血小板聚集过程和血管收缩反应来发挥作用，同时调节宿主的免疫反应（Chagas等人，2014；He等人，2025；Martin-Martin等人，2020）。根据Catalogue of Life（www.catalogueoflife.org），全球已描述了超过2,400种Simuliidae物种，然而到目前为止，尚未从这一家族中鉴定出任何Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂。此外，关于各种动物的Kazal型抑制剂的报道主要集中在抗凝活性上，而它们的抗血小板特性和作用机制仍知之甚少。

在这项研究中，从黑蝇Simulium bannaense的唾液腺中鉴定出一种新的单Kazal结构域抑制剂（Sibakazin），其N端区域具有高度酸性。尽管Sibakazin不会延迟凝血时间，但它对小鼠的血栓形成具有显著的抑制作用。我们阐明了Sibakazin调节血小板功能和抑制腺苷二磷酸（ADP）及胶原蛋白诱导的聚集的分子机制。此外，还研究了Sibakazin的潜在出血风险。图形摘要见图1（由FigDraw绘制）。

部分内容

唾液腺cDNA文库构建和cDNA克隆

从中国云南省西双版纳收集了300只成年Simulium bannaense标本，在无菌条件下解剖以分离唾液腺组织。唾液腺组织立即在液氮中快速冷冻，以确保生物材料的最佳保存。按照既定程序（He等人，2025），首先使用Trizol试剂提取总RNA，然后通过亲和层析纯化mRNA

Sibakazin的特性分析

Sibakazin前体cDNA（GenBank: PV296096）是从S. bannaense唾液腺cDNA文库中克隆并在大肠杆菌中表达的。Sibakazin前体序列包含100个氨基酸，包括一个25个残基的信号肽和一个75个残基的成熟蛋白（图2A）。Sibakazin具有Kazal结构域的特征性三个二硫键，并且N端具有高度酸性。经过HPLC纯化后，重组Sibakazin通过SDS-PAGE进行了表征（GFP

讨论

Kazal型抑制剂，尤其是在吸血动物中发现的抑制剂，因其抗凝特性而被广泛研究（Campos等人，2004；Watanabe等人，2011，2010b）。然而，它们在血小板功能中的调节作用仍大部分未得到探索。在这项研究中，我们从S.bannaense的唾液腺cDNA文库中克隆了一种Kazal型抑制剂（Sibakazin）前体，并在E.coli中表达。我们的发现表明，重组Sibakazin表现出强大的

CRediT作者贡献声明

沈燕：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、数据管理。何彦梅：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、数据管理。林婷：方法学、研究、数据分析。何淼：方法学、研究、数据分析。李卓睿：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析、数据管理。穆立贤：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、研究、数据分析。

数据可用性声明

作者声明，支持本研究中报告的结果的数据、材料和代码可在合理请求下提供。

伦理批准声明

所有与动物相关的实验程序均获得了昆明医科大学动物伦理委员会的批准（批准编号：KMMUD20242023），并符合国际动物研究法规。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（U24A20812、32060119、31970418、81802023）、云南振兴人才支持计划（YUWR-QNBJ-2019-189）以及昆明医科大学的一流学科团队（2024XKTDYS02）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。