《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：The structural and transcriptional basis of carboxylesterase-mediated
λ-cyhalothrin resistance in
Spodoptera litura
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研究揭示了烟草夜蛾λ-环丙酮酯抗性机制，发现COE052、COE054、COE066基因显著过表达，其中COE066通过Asn446和His447关键残基实现高效代谢降解，且受HNF4转录因子调控，形成HNF4-COE调控轴。
李俊|黄晓丹|邓梦清|陈洁萌|周林杰|徐希月|赵新宇|彭睿|杨志明|卢凯
农产品质量与生物安全重点实验室（教育部），安徽省，安徽农业大学植物保护学院作物害虫综合治理重点实验室，合肥，230036，中国
摘要
鳞翅目害虫对拟除虫菊酯的抗性对可持续害虫管理构成了严重威胁。尽管羧酯酶（COEs）参与了代谢抗性的形成，但其确切的功能和调控机制仍不清楚。本研究中发现，一种对λ-氰氯菊酯具有抗性的烟草夜蛾（Spodoptera litura）品系（抗性为93.29倍）的COE活性显著增强。使用三苯基磷酸酯（TPP）进行的协同作用实验证实了COE的参与作用，在敏感品系和抗性品系中，TPP的协同比分别为2.26和2.33，显著提高了λ-氰氯菊酯的毒性。在抗性品系中，三个COE基因（COE052、COE054和COE066）的表达显著上调，其中中肠中的表达分别上调了140.63倍、102.60倍和99.98倍。RNA干扰实验表明，COE052和COE066对抗性至关重要，而COE054的敲低没有影响，这可能是由于其他两个COE的补偿性过表达。在细菌中的异源表达实验表明，这三个COE均能将λ-氰氯菊酯的耐受性提高3.13倍、2.26倍和3.29倍，并表现出抗氧化活性。
体外
代谢实验证实了它们具有降解λ-氰氯菊酯的能力，其中COE066的代谢效率最高（47.20%）。分子对接和突变分析确定COE066中的Asn446和His447是λ-氰氯菊酯结合、代谢和抗氧化功能的关键残基。His447的突变使其结合自由能从-34.96 kcal mol–1降至3.28 kcal mol–1，代谢效率从51.10%降至14.39%，并显著降低了抗氧化活性。此外，转录因子HNF4被发现调节这三个COE的表达，从而建立了HNF4–COE的调控轴，解释了λ-氰氯菊酯抗性的机制。本研究阐明了COE介导的拟除虫菊酯抗性机制，并提出了潜在的抗性管理靶点。
引言
拟除虫菊酯类杀虫剂是田间作物和高价值农产品综合害虫管理（IPM）的基本组成部分，因其广谱杀虫效果、低哺乳动物毒性和有限的环境持久性而受到重视（Rezende-Teixeira等人，2022年）。然而，长期大量使用导致包括烟草夜蛾（Spodoptera litura）在内的主要鳞翅目害虫普遍产生抗性，该物种在中国造成了严重的农业损失（Zhang等人，2022年）。烟草夜蛾在夜蛾科中记录的抗性事件最为频繁，并已对多种杀虫剂类别产生抗性，包括拟除虫菊酯（Sparks等人，2021年）。
λ-氰氯菊酯是一种针对钠通道的拟除虫菊酯，在中国的杀虫剂使用量中占比接近四分之一（Jin等人，2023年）。对该化合物的抗性进化不仅降低了杀虫剂在田间的效果，还促进了杀虫剂的过度使用，加剧了环境污染并破坏了可持续的害虫控制（Bras等人，2022年；Gould等人，2018年）。因此，了解抗性的分子基础对于制定有效的缓解策略至关重要。杀虫剂抗性通过多种机制产生，主要包括代谢隔离、角质层渗透减少、代谢抗性和靶点突变（Hawkins等人，2019年；Ingham等人，2020年）。代谢抗性主要由解毒酶介导，这是田间进化抗性的主要机制。这一过程包括三个阶段：第一阶段主要由细胞色素P450单加氧酶（P450s）和羧酯酶（COEs）催化；第二阶段由谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）辅助；第三阶段涉及通过ABC转运蛋白的代谢排出（Hilliou等人，2021年；Nauen等人，2022年）。尽管这些解毒酶与抗性有关，但在抗性品系中控制其过表达的详细功能和调控途径仍不完全清楚（Xu等人，2020年）。
作为丝氨酸水解酶，COEs通过水解含有酯基的杀虫剂（如拟除虫菊酯）在代谢抗性中起关键作用（Bai等人，2021年；Balaska等人，2025年；Bhatt等人，2021年）。它们的保守结构，特别是对水解活性至关重要的丝氨酸、组氨酸和谷氨酸残基的三联体（Wheelock等人，2005年），以及通常包含与催化丝氨酸相邻的保守甘氨酸残基的底物结合口袋，稳定了酶-底物中间体（Gunning等人，2007年）。虽然核心结构是保守的，但周围残基的变化会影响底物特异性和催化效率（Yang等人，2014年）。活性位点或其附近的关键氨基酸替换可以改变构象动态，影响底物可及性并降低抑制剂敏感性，而不影响天然酯酶的功能。正如定点突变研究所示，这种突变在杀虫剂选择压力下增强了代谢能力（Li等人，2021年）。例如，甘氨酸替换为丙氨酸或苯丙氨酸替换为酪氨酸与有机磷抑制剂的敏感性降低有关，但不会影响天然酯酶的功能（Campbell等人，1998年；Claudianos等人，1999年）。除了水解作用外，COEs还可以隔离杀虫剂并表现出抗氧化活性，进一步支持其解毒能力（Hopkins等人，2017年；Satoh和Hosokawa，2006年）。多个昆虫的抗性都与COEs的过表达有关（Feng等人，2018年）。在烟草夜蛾中，几个COEs参与了植物化感物质和合成杀虫剂的解毒。例如，COE054具有立体选择性代谢β-氰氯菊酯，而其他COE则被各种外源物质诱导（Li等人，2023年；Shi等人，2022年；Xu等人，2024年）。我们最近的研究发现了一个特定于鳞翅目的COE基因簇扩展，有助于黄曲毒素的解毒（Huang等人，2025a；Li等人，2025年）。然而，大多数COE在拟除虫菊酯抗性中的功能和结构基础仍不明确。
解毒基因的转录调控是抗性控制的重要层面（Amezian和Leeuwen，2025年；Lu等人，2021c）。多种信号通路参与这一调控，包括cap ‘n’ collar异构体C（CncC）/肌肉腱膜纤维瘤（Maf）复合体、芳烃受体（AhR）/ARNT异二聚体以及20-羟基蜕皮酮（20E）-蜕皮酮受体（EcR）/气门（USP）通路（Deng等人，2026a；Lu等人，2020年；Xiao等人，2025a）。核受体（NRs）是一类配体调节的转录因子，在代谢稳态中起核心作用，并已成为响应外源物质时解毒基因的关键调节因子（Amezian等人，2021年）。其中，肝细胞核因子4（HNF4）是哺乳动物HNF4α的同源物，属于NR2A亚家族，被认为是关键调节因子。虽然HNF4以其在脂质代谢和卵发生中的作用而闻名，但最新证据表明它也影响杀虫剂抗性，例如在Nilaparvata lugens中，其敲低提高了P450和UGT介导的吡虫啉解毒作用（Almeida-Oliveira等人，2021年；Cheng等人，2021年；Vonolfen等人，2024年）。然而，HNF4在COE介导的拟除虫菊酯解毒中的调控作用仍很大程度上未被探索，这在NR依赖的抗性机制中是一个重要的知识空白。
在这项研究中，我们确定了三个在λ-氰氯菊酯抗性烟草夜蛾品系中显著过表达的COEs（COE052、COE054和COE066）。功能分析表明，COE066在代谢解毒中起核心作用，对λ-氰氯菊酯的降解活性最高。结构和突变研究确定Asn446和His447是介导杀虫剂结合和解毒效率的关键残基。此外，我们证明这些COE的表达受转录因子HNF4的调控，而HNF4在抗性品系中也上调。这些发现建立了拟除虫菊酯抗性中的新型HNF4–COE调控轴，提供了新的机制见解和潜在的抗性管理靶点。
部分摘录
昆虫和生物测定
本研究使用了两种烟草夜蛾（Spodoptera litura）品系。实验室敏感品系（Sus）来自中山大学（广州，中国），而田间抗性品系（Res）则来自安徽农业大学的实验田（合肥，中国）。这两种品系均在26 ± 1 °C、65 ± 5%相对湿度和16:8光照周期的受控环境下饲养。
TPP和COE酶活性对λ-氰氯菊酯毒性的协同效应
生物测定结果表明，从田间采集的Res品系对λ-氰氯菊酯具有高度抗性，抗性比（RR）为93.29，而Sus品系的抗性比为1。为了研究COEs在这一抗性中的潜在作用，使用了特定的COE抑制剂TPP作为增效剂。协同生物测定显示，TPP显著提高了两种品系幼虫对λ-氰氯菊酯的敏感性，Sus品系的协同比分别为2.26和2.33。
讨论
烟草夜蛾对λ-氰氯菊酯的抗性进化对可持续农业构成了严重威胁（Cheng等人，2017年；Zhang等人，2022年）。在这项研究中，我们鉴定了一种具有高度抗性（93.29倍）的田间衍生品系，其中特定COEs的过表达是抗性的主要贡献因素。TPP增效剂生物测定证实了COEs的显著作用，将抗性比从93.29降低到40.12。这表明COE介导的代谢
结论
总之，本研究表明，烟草夜蛾对λ-氰氯菊酯的抗性是通过HNF4驱动的关键COEs的转录放大以及COE066的固有功能多样性来实现的。调控创新与结构模块化之间的进化相互作用为理解害虫的代谢韧性提供了机制框架。这些发现不仅推进了解毒系统的基本知识，还突出了分子靶点
CRediT作者贡献声明
邓梦清：撰写 – 审稿与编辑、资源准备、方法论、概念构思。黄晓丹：验证、资源准备、方法论、调查、数据管理。周林杰：验证、资源准备、调查、数据管理。陈洁萌：验证、资源准备、调查、数据管理。卢凯：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、方法论、资金获取、概念构思。杨志明：项目协调、资金管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32572807）和安徽农业大学的人才计划（编号rc342112和rc342215）的财政支持。
