纳米结构的细菌纤维素膜作为黑色素细胞移植的高性能支架

《International Journal of Biological Macromolecules》：Nanostructured bacterial cellulose membranes as high-performance scaffolds for melanocyte transplantation

本研究探索细菌纤维素（BC）膜作为黑色素细胞（MC）移植支架，通过预纤丝化BC纳米纤丝并采用四种干燥方法优化结构。发现空气干燥BC膜（AD-BC）机械性能优异（湿态拉伸强度10.2 MPa），经等离子体处理后MC粘附率达90%，并保持高存活率与黑色素分泌。小鼠实验证实AD-BC组细胞定植效果优于传统悬液移植。该研究为BC膜在白癜风治疗中的应用提供了新思路。

　　

金婷|刘飞燕|金荣|曹成|徐艾|杨轩|王文军

教育部生物质化学工程重点实验室，化学工程与低碳技术国家重点实验室，浙江大学化学与生物工程学院，杭州，310058，中国

摘要

黑色素细胞（MC）悬浮液移植是治疗白癜风的一种有前景的方法，然而，悬浮液的高流动性导致的泄漏问题仍然是一个重大挑战。本研究探讨了细菌纤维素（BC）膜作为MC移植的新支架材料，评估了其结构和机械性能，以及支持细胞存活的能力。这些膜是通过预成纤的BC纳米纤维组装而成的，然后采用四种干燥方法——热压干燥、真空烘箱干燥、空气干燥和冷冻干燥——来调整材料结构。除了制备简便外，空气干燥的BC在机械强度、柔韧性、透气性、液体吸收和保持能力方面表现出色，甚至超过了胶原蛋白、壳聚糖和羊膜等传统支架材料。等离子体表面处理进一步增强了MC的粘附性（约90%），同时不损害支架的物理性能。体外分析证实了MC的高存活率、持续的黑色素生成和结构保持，而在小鼠皮肤上的试验显示，与传统悬浮液移植方法相比，该方法能有效促进细胞植入并改善细胞定位。这些发现表明BC膜是一种坚固且生物相容性良好的支架材料，具有显著提高白癜风治疗效果的潜力。

引言

白癜风是一种常见的自身免疫性皮肤病，影响全球0.5-2%的人口，其特征是选择性破坏黑色素细胞（MC）和色素脱失[1]。治疗方法包括药物治疗、光疗和手术。虽然皮质类固醇被广泛使用，但它们存在皮肤萎缩和毛囊炎等风险[2]。窄谱UVB光疗具有更好的色素再生效果且副作用较少，但在某些解剖区域无效，且需要密集的治疗方案[3]。对于对保守治疗无反应的稳定型白癜风，黑色素细胞移植是有效的方法，尤其是在难以处理的区域，尽管技术要求较高[2]。这涉及在体外采集和扩增黑色素细胞，然后将其应用于磨削或激光消融的皮肤上。然而，细胞从非平坦或移动部位移位仍然是主要障碍，显著降低了色素再生的成功率[4]。已经提出了一些策略，如添加透明质酸以增加悬浮液的粘度，或应用涂有粘合剂的聚合物纤维来定义移植边缘，但这些方法可能会影响细胞分布，并且难以去除[5]，[6]。然而，这些方法可能会改变局部细胞浓度，并在治疗后带来去除困难。

组织工程支架是模仿细胞外基质（ECM）的临时结构，支持细胞生长和组织再生[7]，[8]，[9]。基于膜的支架已被用于黑色素细胞移植的研究。胶原蛋白膜具有优异的生物相容性和细胞粘附性，但存在快速降解、湿态机械强度低（杨氏模量：5-30 MPa；拉伸强度：5-15 MPa）和潜在的免疫原性[10]，[11]。壳聚糖膜通过其正电荷促进细胞附着[12]，[13]，[14]，但机械强度低（模量2-5 MPa），可能导致细胞聚集[15]，[16]，[17]。羊膜因其抗炎和抗菌特性而显示出临床前景，但效果因供体质量而异[18]。合成聚合物，如聚乳酸和聚乙醇酸，具有可调性，但通常缺乏通透性，并且在应用过程中可能会释放乳酸、乙醇酸或己酸等酸性降解产物，这对细胞有害[19]，[20]。这些限制凸显了需要生物相容性、机械耐用性和支持黑色素细胞功能的支架材料的需求。在天然聚合物中，纤维素（包括纤维素纳米纤维（CNF）、纤维素纳米晶体（CNC）和细菌纤维素（BC）因其优异的生物相容性、可调结构和在靶向药物输送和组织支架等生物医学应用中的潜力而成为有希望的候选材料[21]，[22]。

细菌纤维素（BC）由诸如Acetobacter xylinum等细菌产生，在生物医学应用中因其高纯度、机械完整性和生物相容性而脱颖而出。BC具有独特的三维纳米纤维网络和微孔性[23]、高水分保持能力和优异的机械性能[24]，[25]，使其适合用于细胞移植[26]，[27]，[28]，[29]。这些有利特性源于其20-100纳米的细直径、微米级的长度和亲水表面。

BC膜已在各种组织工程背景下进行了研究[30]。Svensson等人证明BC支持软骨细胞的粘附和增殖[31]，而Geisel等人和Zhu等人分别证实了其与神经干细胞和施万细胞的生物相容性[32]，[33]。特别是在皮肤组织工程中得到了广泛研究，例如Evelyn等人证明用作伤口敷料的细菌纤维素显著促进并加速了皮肤伤口愈合[34]，而Sajjad等人将其开发成纳米复合材料，作为烧伤伤口再生的新选择[35]。为了进一步改善细胞-支架相互作用，等离子体处理（尤其是N₂处理）被用作有效的表面工程策略。这种物理修饰能够在保持BC膜的宏观结构和机械完整性的同时，精确调节表面化学成分和润湿性[36]，[37]。总体而言，这些研究表明BC是一种机械坚固且生物学上有利于多种细胞类型的支架材料。

除了作为被动支架外，BC膜还可以分解成纳米纤维并重新组装成具有可调内部纳米结构、表面粗糙度和整体几何形状的3D结构材料，提供有利的机械性能和改善的细胞-材料相互作用[38]。这种重组策略克服了天然生物合成BC膜的关键限制，后者的孔隙结构和表面形态大多固定，可能存在批次间或样本间的差异[39]，[40]。重要的是，BC材料尚未被探索作为黑色素细胞移植的支架材料[41]，[42]。

在这项研究中，我们研究了BC膜作为黑色素细胞移植的支架材料。首先将原始BC纳米纤维化，然后重新组装成具有可调物理性能的膜。比较了四种干燥方法，并系统评估了所得膜的机械强度、柔韧性、液体处理能力和剪切/剥离粘附性能。基于结构-功能关系，我们假设致密且多孔的膜将提供更优的整体性能，以支持黑色素细胞移植。优化的空气干燥BC膜表现出高的MC粘附性，保持了黑色素含量，并随时间维持了细胞器的完整性，表明其具有优异的生物相容性。在此基础上，AD-BC膜经过等离子体处理，进一步增强了细胞粘附性。此外，在小鼠皮肤模型上的体外移植显示，与传统基于悬浮液的移植方法相比，MC的保留和定位显著改善。这些结果表明，BC膜是一个有前景的平台，可用于靶向和持续的黑色素细胞移植，在白癜风治疗中具有很强的临床应用潜力。

材料

原始BC材料以膜的形式提供（32 × 24 × 0.3 cm，纤维素纯度约99%），购自海南叶国食品有限公司。将膜切成3 × 3 cm的片材，并在80°C下用1%氢氧化钠溶液处理1小时，同时进行机械搅拌（500 rpm；pH = 7）。然后用去离子水彻底清洗样品，并使用分子量截留率为8-14 kDa的透析管进行两周的透析，直到pH达到中性。MC在DMEM F12培养基中培养

BC纳米纤维的制备

为了制备具有可调结构和性能的BC膜支架，首先将原始BC材料分解成BC纳米纤维，然后可以将其重新组装成具有可控结构的膜。具体来说，将原始BC彻底清洗并使用高速搅拌机进行机械成纤。如AFM图像（图1）所示，所得BC纳米纤维的平均直径约为20 nm，长度超过几微米，与先前的研究一致[47]。

结论

本研究探讨了使用细菌纤维素膜作为黑色素细胞移植的支架材料，并据我们所知，这是BC在这一领域的首次成功应用。通过将原始BC分解成纳米纤维并应用四种不同的干燥方法，我们确定空气干燥的BC（AD-BC）膜是最优候选材料，它结合了良好的机械强度（湿态下拉伸强度为10.2 MPa）、柔韧性和高水分吸收率（约250%）

CRediT作者贡献声明

金婷：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。刘飞燕：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。金荣：方法学、研究。曹成：方法学、研究。徐艾：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。杨轩：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、概念化。王文军：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家重点研发计划（2023YFC2508200）、国家自然科学基金（22278359）、国家自然科学基金（联合基金项目U22A20310）、中央高校基本科研业务费（226-2024-00060）以及衢州科技项目（2024Z012）的资助。我们感谢沈苏丹、郑娜、蒲群（化学工程与低碳技术国家重点实验室）的支持