含有海洋弹性蛋白水解物的聚乙烯醇/果胶水凝胶，用于促进伤口愈合和细胞外基质重塑

《International Journal of Biological Macromolecules》：Polyvinyl alcohol/pectin hydrogels incorporating marine elastin hydrolysates for enhanced wound healing and extracellular matrix remodeling

本研究开发了一种含海洋弹性蛋白水解物的PVA/pectin水凝胶敷料。通过体外实验证明水解物促进成纤维细胞迁移和胶原表达，经冻融交联制备的水凝胶具有良好生物相容性和物理性能，在小鼠伤口模型中显著加速愈合并促进胶原沉积。

　　

Moon成熙 | Kim世昌 | Kim南君 | Heo成英 | Heo秀珍 | Park元顺 | Choi一焕 | UmWooram | Lee世正 | LeeBongii | Je在英 | KhanFazlurrahman | Kim英莫格 | Nguyen Vu Linh | Kim泰熙 | Jung元京

韩国济州海洋科学技术院（KIOST）济州生物研究中心

摘要

水凝胶因其优异的保水能力和生物相容性而被广泛用于先进的伤口护理中。然而，它们有限的生物活性常常阻碍了有效的组织再生。尽管源自海洋的生物分子具有相当大的再生潜力，但在基于水凝胶的伤口敷料系统中仍尚未得到充分研究。在这项研究中，我们旨在通过将海洋来源的弹性蛋白水解物掺入物理交联的聚乙烯醇（PVA）/果胶基质中来开发一种生物活性水凝胶，以促进细胞外基质的重塑。从不丹鱼（Thunnus orientalis）的动脉球中分离出不溶性弹性蛋白（IET），对其进行表征，并使用碱性蛋白酶（Al-IET）或胃肠道酶（GI-IET）进行水解。水解物表现出与人类真皮成纤维细胞（HDFs）和角质形成细胞的良好体外生物相容性。在HDFs中，Al-IET和GI-IET上调了I型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达。划痕实验表明，Al-IET以剂量和时间依赖的方式促进了成纤维细胞的迁移，表明其在早期伤口愈合中的作用。通过冻融交联将Al-IET掺入PVA/Pectin水凝胶中。所得水凝胶具有良好的物理化学性质、膨胀行为、药物释放能力和流变稳定性，且无细胞毒性。此外，水凝胶提取物还促进了HDF的迁移。在鼠背侧伤口模型中，含有0.025% Al-IET的PVA/Pectin水凝胶显著加速了伤口闭合，并在受伤后第14天增强了组织再生。这些发现突显了含有弹性蛋白水解物的PVA/Pectin水凝胶作为具有结构完整性的生物活性伤口敷料的潜力。

引言

传统的伤口敷料，如纱布和合成薄膜，主要作为防止外部污染的被动物理屏障。它们往往无法维持最佳的湿润环境，导致愈合延迟以及移除后可能造成的组织损伤[1]。相比之下，水凝胶是亲水性的三维聚合物网络，能够吸收和保持大量水分[2]。因此，水凝胶敷料可以创造一个湿润的微环境，促进细胞迁移、增殖和细胞外基质（ECM）的重塑，同时减少疼痛和疤痕形成[3]。因此，它们被广泛用于先进的伤口护理。此外，由于其固有的生物相容性、可降解性和可调的物理化学性质，水凝胶越来越被视为功能性伤口敷料的有希望的载体[4]。多功能水凝胶除了具有药物输送能力外，还具有抗菌、抗炎和抗氧化活性[5]。这些性质协同作用，加速了组织再生并促进了伤口愈合[6]。 基于多糖的水凝胶系统，如海藻酸盐、壳聚糖和果胶，因其天然来源、优异的生物相容性和内在的生物活性而受到关注[7]。这些水凝胶由线性或分支链组成，含有丰富的羟基、羧基、氨基和硫酸基团，能够形成离子相互作用、氢键和共价交联，从而形成稳定的三维网络[8]。通过调节聚合物浓度、分子量、取代度和交联密度，可以控制其物理化学性质，如膨胀行为、降解速率和机械强度[9]。此外，多糖本身具有抗氧化、免疫调节和抗菌等内在生物活性，这些活性通过调节炎症、促进血管生成和加速再上皮化来协同促进伤口愈合[10]。因此，多糖被广泛用作伤口愈合材料的关键成分。 果胶是一种植物细胞壁阴离子多糖，其骨架结构由通过α-(1→4)糖苷键连接的d-半乳糖醛酸单元组成[11]。由于其两亲性质，它可以与各种亲水性和疏水性物质相互作用，因此在食品、制药和生物医学行业中得到广泛应用[12]。此外，它表现出优异的生物相容性和良好的体外细胞粘附性，使其成为组织工程和伤口愈合应用的有希望的材料[13]。纯果胶水凝胶通常具有较低的拉伸强度，并且在水环境中快速溶解，限制了其功能持久性[14]。为了提高其机械稳定性和功能持久性，采用了离子交联和掺入合成或天然聚合物（如聚乙烯醇（PVA）和壳聚糖）等策略[15]，从而扩大了其在伤口敷料和药物输送系统中的应用[16]。 基于水凝胶的伤口敷料应在伤口部位保持湿润环境，同时具有足够的机械强度和弹性，以承受使用过程中的变形和损伤[17]。PVA因其良好的生物相容性和化学稳定性以及增强机械脆弱亲水网络的能力而被广泛用作增强聚合物[18]。值得注意的是，PVA通过冻融循环和链间氢键形成物理交联的水凝胶，无需化学交联剂即可产生稳定且弹性强的网络[19]。因此，将果胶与PVA混合预计可以进一步提高结构稳定性，同时通过PVA的羟基与果胶的羧基/羟基之间的分子间氢键保持亲水性[20]。 弹性蛋白是ECM的关键结构成分，在弹性组织（如主动脉、肺、韧带和皮肤）中含量丰富[21]。其弹性来源于其独特的氨基酸序列，该序列包含交替的疏水域和富含赖氨酸的区域，这些区域通过桥连蛋白和异桥连蛋白共价交联。这些交联赋予弹性蛋白弹性回弹力和卓越的机械稳定性，使其高度不溶于水[22]。弹性蛋白可以通过酶促水解或酸水解产生水溶性弹性蛋白水解物，这些水解物表现出多种生物活性。例如，禽类皮肤弹性蛋白水解物通过清除自由基和螯合金属表现出强抗氧化活性[23]。它已被开发成具有良好物理化学性质的生物相容性软膏[24]，并因其保湿功能而被纳入化妆品配方中[25]。牛韧带弹性蛋白配方可能促进再上皮化和伤口愈合[26]，而马颈韧带弹性蛋白可能促进真皮成纤维细胞中的ECM蛋白沉积并调节巨噬细胞表型[27]。这些发现表明弹性蛋白作为伤口愈合材料的潜力。 弹性蛋白通常从陆地动物中提取，这引发了关于宗教可接受性、环境影响和人畜共患病风险的担忧。因此，具有低免疫原性和高生物相容性的海洋生物材料受到了越来越多的关注[28]。例如，口服鲣鱼弹性蛋白已被证明可以改善皱纹、增加皮肤水分并减少黑色素指数[29]。类似地，含有黄尾鱼动脉球（BA）弹性蛋白的乳液可以缓解光老化，减少皱纹形成和表皮增厚[30]。在这项研究中，弹性蛋白是从鲣鱼（Thunnus orientalis）的动脉球中提取的，这是鱼类加工的副产品。这种硬骨鱼的动脉球特别富含弹性蛋白，因为该组织中高度表达特定于这一物种的弹性蛋白b基因（elnb）[31]。使用来自鲣鱼的弹性蛋白避免了与陆地动物来源相关的担忧，提供了一种安全且成本效益高的生物材料，具有重要的组织工程应用潜力。 基于弹性蛋白的水凝胶因其固有的弹性和对湿润组织的粘附性而被广泛用作伤口敷料。大多数弹性蛋白水凝胶基于化学功能化和光交联过程，而使用海洋弹性蛋白作为伤口敷料中的生物活性添加剂的研究较少[32]。因此，我们旨在验证海洋来源的弹性蛋白水解物作为无需化学交联剂的物理交联系统中的生物活性成分的有效性。这种方法可能同时确保伤口敷料应用的过程简单性和实用性[33]。 我们假设将鱼弹性蛋白水解物掺入PVA/Pectin水凝胶基质中，可以增强其作为伤口敷料的生物功能，通过改善保湿性、机械稳定性和生物活性来促进伤口愈合。为了验证这一假设，我们首先评估了鲣鱼动脉球来源的弹性蛋白水解物刺激成纤维细胞活性以及上调胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的能力，这是伤口愈合的关键过程。接下来，我们开发了一种含有海洋弹性蛋白水解物的物理交联PVA/Pectin网络水凝胶。对所制备的水凝胶的物理化学性质、生物相容性和伤口愈合效果进行了系统评估。

材料

原始鲣鱼（T. orientalis）动脉球来自韩国釜山的东元渔业公司。不溶性弹性蛋白（ES60）从美国密苏里州欧文斯维尔的Elastin Products Company, Inc.获得。碱性蛋白酶从丹麦Bagsvaerd的Novozymes Nordisk购买，胰蛋白酶从日本东京的东京化学工业有限公司购买。胃蛋白酶、PVA（341,584；分子量=89,000–98,000 Da；99%水解）、柑橘果胶（P9135；干基中半乳糖醛酸≥74%和甲氧基≥6.7%；分子

不溶性弹性蛋白的提取和水解物的制备

IET采用热碱法提取（图1A）[39]。动脉球组织经过洗涤并切成小块。使用1 M NaCl处理后用丙酮有效去除盐溶性蛋白质和脂质成分。然后对组织进行均质化，并在0.1 M NaOH中加热处理以进一步去除非弹性蛋白成分。通过离心收集不溶性弹性蛋白颗粒，并通过冻干获得粉末形式的IET。提取产率为0.17 ± 0.01%

结论

我们成功开发了一种含有海洋弹性蛋白水解物（Al-IET）的生物活性PVA/Pectin水凝胶，用于伤口愈合。弹性蛋白从T. orientalis的动脉球中提取，并用碱性蛋白酶水解得到Al-IET，该水解物促进了成纤维细胞的迁移并上调了与ECM相关的蛋白质（COLI和α-SMA），直接支持了ECM的重塑。Al-IET水解物被加载到使用冻融方法制备的PVA/Pectin水凝胶中。PVA提供了机械稳定性和柔韧性

CRediT作者贡献声明

Moon成熙：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、概念化。 Kim世昌：方法学、概念化。 Kim南君：验证、方法学、研究、概念化。 Heo成英：验证、方法学、研究、概念化。 Heo秀珍：撰写——审阅与编辑。 Park元顺：方法学、数据管理。 Choi一焕：正式分析。 UmWooram：正式分析。 Lee世正：可视化。

资助

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过基础科学研究计划（RS-2021-NR060118和RS-2025-00519169）的支持；韩国海洋科学技术院（KIMST）资助的海洋渔业副产品的生物材料化技术开发项目（由海洋渔业部资助，RS-2022-KS221555）；以及浦项国立大学资助的全球联合研究计划（

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

无。