《Metabolic Engineering》：Substrate-informed metabolic engineering of
Corynebacterium glutamicum enables balanced glucose–xylose co-utilization for the valorization of lignocellulosic feedstocks
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本文报道了研究人员针对微生物利用木质纤维素水解液中葡萄糖和木糖时存在的底物层级和碳分解代谢物阻遏（CCR）问题，开展了基于底物信息的代谢工程研究。通过在谷氨酸棒杆菌中系统设计并导入异源木糖利用模块（xylAB），结合转运体优化和表达强度精细调控，成功构建了一个能够实现稳定、近乎转录独立的葡萄糖-木糖平衡共利用的代谢体系。该体系成功应用于纸板水解液（CBH）这一废弃物流的转化，并在工业L-赖氨酸生产菌株中实现了高效生产，为异质碳源的生物炼制提供了可扩展且鲁棒的新策略。
微生物是大自然卓越的“微型工厂”，能将简单的糖分转化为各种有价值的化学品。然而，在利用自然界最丰富的植物资源——木质纤维素时，这些“工厂”却常常“挑食”。木质纤维素水解液中的糖分主要是葡萄糖和木糖，但绝大多数微生物，包括许多重要的工业菌株，都优先、甚至只消耗葡萄糖，而将木糖晾在一边。这种现象被称为“底物层级”，其背后的核心机制是碳分解代谢物阻遏。这不仅导致碳源利用不充分，也严重制约了以农业残余物、废纸等可再生资源为原料的生物制造过程的效率和经济效益。
针对这一瓶颈，一支由David J. Mees等人组成的国际研究团队在《Metabolic Engineering》杂志上发表了一项创新性研究。他们以著名的工业微生物——谷氨酸棒杆菌为平台，开发了一套“底物导向”的代谢工程策略，旨在从根本上克服葡萄糖与木糖的利用障碍，实现稳定、高效的同步消耗，从而为高效转化木质纤维素类废弃物铺平道路。
为了达成目标，研究人员采用了系统性的代谢工程、生理学、酶学、转录组学及13C同位素示踪分析相结合的综合性研究方法。核心工作包括：针对代表性废弃物纸板水解液（CBH）的固定糖比例（葡萄糖:木糖≈4:1），构建了包含34个工程菌株的组合文库，系统性地改变了木糖利用模块（xylAB）的来源、转运体类型、启动子强度和基因剂量。通过整合多维数据，深入解析了菌株的代谢表型、酶活、全局基因表达和碳流走向，从而鉴定出具有理想共利用行为的菌株。
3.1. 通过异源xylAB模块建立木糖分解代谢
研究人员首先从四种不同微生物中引入了木糖异构酶（XylA）和木糖激酶（XylB）基因，构建了基础木糖利用菌株。结果表明，源自大肠杆菌和野油菜黄单胞菌的xylAB模块在谷氨酸棒杆菌中表现出最佳的初始木糖利用能力，但木糖摄取仍受葡萄糖存在抑制。
3.2. 通过转运体工程增强木糖摄取
为了解决摄取限制，研究引入了大肠杆菌的木糖-质子同向转运体XylE。这一改进显著提升了木糖同化速率，部分菌株甚至出现了木糖优先消耗的现象，表明转运体工程是克服底物层级的关键步骤。
3.3. 高效的葡萄糖-木糖共利用需要平衡的XylA/XylB活性
酶活测定揭示，高效的共利用不仅需要高酶活，更需要XylA与XylB活性之间的良好平衡。活性失衡的菌株，即使单个酶活很高，其共利用效率也较低。
3.4. xylA和xylB表达中的基因剂量效应
增加xylA或xylB的基因拷贝数可以进一步提高木糖利用，但其效果依赖于模块背景，且并非线性增加。过度的xylA表达甚至可能导致代谢流向木糖严重倾斜。
3.5. 启动子强度决定多顺反子xylAB表达效率
研究尝试了不同强度的启动子来驱动xylAB表达。出人意料的是，过强的启动子导致酶活大幅下降和共利用失败，而中等强度的启动子（如Psod）却能产生酶活平衡、共利用高效的优良菌株（如XYL-6A和XYL-6B），表明适度的表达水平对维持途径功能至关重要。
3.6. 通过替代转运体选择精细调控共利用
在最优底盘（XYL-6A/B）中测试了不同来源的糖转运体。发现来自枯草芽孢杆菌的阿拉伯糖转运体AraE能够赋予菌株显著的木糖利用偏好，这表明转运体身份是调控碳流分配的有力工具。
3.7. 工程化谷氨酸棒杆菌菌株的基准测试及在纸板水解液上的验证
对全部34个菌株进行性能评估，设定了生长速率、共利用比和底物摄取速率三项基准。只有少数菌株（如XYL-2B， XYL-6A， XYL-6B）能同时满足所有标准。重要的是，这些优选菌株在真实的纸板水解液上也表现出优异的共利用性能和鲁棒性，证明了工程策略的实用性。
3.8. 顶级菌株在不同糖比例混合物中的性能
测试表明，优选菌株能够在宽范围的葡萄糖-木糖比例下生长，其中XYL-6A在各种比例下都保持了最高的比生长速率，展现了其作为“通用型”共利用菌株的潜力。
3.9. 转录组分析将共利用效率与转运调控联系起来
对XYL-6A在不同糖比例下的转录组分析显示，全局转录重编程非常有限。差异表达基因主要集中于糖转运相关基因（如ptsG下调），而中心碳代谢基因基本不受影响。这证明其高效的共利用表型主要源于工程化的途径平衡和转运活性，而非广泛的转录调控。
3.10. 13C示踪分析揭示碳完全收敛及通路特异性底物特征
使用13C标记葡萄糖和未标记木糖进行培养实验。质谱分析显示，葡萄糖和木糖来源的碳在果糖-6-磷酸/甘油醛-3-磷酸节点早期、按固定比例完全融合，形成了一个共享的中心代谢库。特异的同位素标记模式仅限于木糖途径的直接入口代谢物。这从代谢通量层面证实了XYL-6A实现了稳定、比例恒定的碳流汇合。
3.11. 利用优化的木糖分解代谢模块从纸板水解液生产赖氨酸
将XYL-6A中最优的xylAB-xylE模块导入一株工业L-赖氨酸生产菌。所得工程菌能高效共利用纸板水解液中的葡萄糖和木糖，并产生了与亲本菌株在纯葡萄糖上相当的赖氨酸产量，证明了该共利用模块与生产途径的良好兼容性。
本研究建立了一个系统的、底物导向的代谢工程框架，成功地在谷氨酸棒杆菌中实现了稳定、平衡的葡萄糖-木糖共利用。核心发现是，这种共利用行为并非简单地由引入木糖代谢途径而来，而是需要通过精细协调转运体能力与细胞内途径动力学，在一个狭窄的设计窗口内才能获得。代表性菌株XYL-6A展现了一种近乎转录独立的、动力学平衡的代谢状态，其葡萄糖和木糖来源的碳流在中心代谢早期节点按固定比例融合，且该比例不随底物浓度或生长阶段而改变。
这项研究的意义重大。首先，它从机理上深化了对微生物混合糖利用的理解，强调了转运和酶动力学平衡相对于全局转录调控的主导作用。其次，它提供了一种可预测、可扩展的代谢工程范式，即通过“底物信息”指导的理性设计来创建鲁棒的细胞工厂。最后，也是最重要的，该研究直接将工程目标与真实的工业废弃物——纸板水解液的组成相匹配，并成功验证。所开发的菌株能够高效转化这种大量存在、未充分利用的资源，为基于木质纤维素类废弃物的可持续生物制造提供了强大的平台技术和有希望的候选菌株，有力推动了循环生物经济的发展。
