《ACS Chemical Biology》：Avoiding Mitochondrial Apoptosis by the Bcl-2-Driven Bax Oligomerization on Membrane Surfaces
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本研究通过中子反射测量（NR）和衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）等技术，揭示了抗凋亡蛋白Bcl-2在线粒体外膜（MOM）环境中介导促凋亡蛋白Bax失活的新机制。研究表明，Bcl-2不仅通过异二聚化结合Bax，更驱动其在膜表面形成非穿孔性的寡聚体结构，从而抑制细胞凋亡的启动。这一发现为理解癌细胞中Bcl-2过表达导致凋亡抵抗提供了关键的分子水平证据。
引言
细胞凋亡是一种受调控的细胞死亡形式，对人类的发育和健康至关重要。在内源性凋亡通路被激活后，细胞的清除过程需要其“动力源”——线粒体的深度参与。在此过程中，线粒体外膜（MOM）发生通透化，释放出包括细胞色素c在内的凋亡因子，从而触发不可逆的信号级联反应，导致细胞死亡。为避免健康细胞被意外清除，该通路受到Bcl-2（B细胞CLL/淋巴瘤-2）蛋白家族的严格调控。该家族主要由被称为“守护者”（抗凋亡/促生存）和“执行者”（促凋亡/细胞杀伤）的两大类多结构域Bcl-2蛋白组成。为了调控任何凋亡活动，这些对立的家族成员在MOM上相遇并相互作用，以决定细胞的命运：通过保证MOM完整性而存活，或通过诱导膜泄漏而死亡。
在凋亡刺激后，促凋亡的Bcl-2家族成员，如著名的Bax蛋白，会从单体、非活性的胞质状态转变为膜活性状态。转位至MOM后，Bax经历进一步的激活步骤和二聚化，在膜上形成同源寡聚结构，如弧、线和环状孔。所有这些结构都被认为会穿孔MOM。为了通过Bax保护健康细胞免于非预期的凋亡，膜结合的Bcl-2等抗凋亡守护者通过隔离激活的Bax及其相关蛋白来维持线粒体完整性，这一机制也被肿瘤细胞利用以确保其生存。在近50%的人类癌症中，Bcl-2蛋白通过上调等方式参与促进肿瘤发展和治疗抵抗，主要是通过阻断Bax等凋亡蛋白来降低细胞对凋亡的敏感性。
尽管过去几十年在揭示Bcl-2家族调控凋亡的细胞和分子机制方面取得了巨大进展，但抗凋亡Bcl-2蛋白在线粒体外膜水平如何将Bax隔离成紧密复合物以阻止其致死作用的根本机制仍未在基础水平上得到理解；这主要是由于缺乏对这些防止凋亡的蛋白质组装体的生成和组织进行深入的分子层面洞察。
结果
Bcl-2在膜表面隔离Bax，阻止孔道形成
研究使用中子反射测量（NR）来定量解析Bcl-2在膜水平抑制Bax并防止凋亡孔形成的分子机制。实验采用了模拟MOM的模型生物膜。研究发现，在含有Bcl-2的POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷酸胆碱）膜中，Bax主要分布在膜表面，而没有观察到膜穿孔或破坏。这与不含Bcl-2的POPC膜中Bax诱导膜破坏和孔形成形成了鲜明对比。膜表面结合的Bax数量与MOM模型中Bcl-2的含量呈直接正相关，这表明两种蛋白质之间存在直接相互作用，很可能是Bcl-2/Bax复合物在膜界面的形成。观察到的Bax分布远离膜表面提示，Bcl-2不仅将Bax隔离成1:1复合物，还诱导Bax寡聚体在双层膜外表面形成。
对Bax与含Bcl-2的POPC囊泡结合的电子显微镜（EM）成像结果支持了NR的发现。在Bax结合之前，观察到Bcl-2作为明显的“凹口”嵌入脂双层中。Bax结合到囊泡表面后，未观察到囊泡破坏，并且在膜表面观察到了离散的Bax蛋白分布，类似于NR揭示的Bcl-2结合的Bax层。
Bax/Bcl-2复合物形成的动力学
结合时间分辨中子反射测量（TR-NR）和ATR-FTIR来研究Bcl-2隔离Bax过程的时间依赖性。对Bax与含Bcl-2的氘代POPC双层相互作用的ATR-FTIR分析，通过蛋白质酰胺I带的时间依赖性增加，揭示了一个两阶段的结合过程。该过程包括一个时间常数为9 ± 1分钟的初始快速组分，以及一个时间常数为148 ± 11分钟的较慢次级过程。TR-NR分析虽然时间分辨率较低，但对膜表面蛋白质含量变化的分析揭示了ATR-FTIR测量中发现的较慢次级过程（时间常数为163 ± 11分钟）。
TR-NR分析揭示了Bax寡聚体在POPC/Bcl-2表面的时间演变。最初，一个主要是单体的Bax层（约25 ?厚）从溶液结合到SLB表面；这很可能反映了ATR-FTIR揭示的快速过程。随后，Bax层的厚度加倍至约50 ?层，这与Bax寡聚体的形成一致，其在膜表面的覆盖率增加。最后，一个额外的、覆盖率可分辨的Bax寡聚体层似乎结合到了这一层上，其表面覆盖率也在增加。Bax在膜表面的寡聚化被解释为一个缓慢的次级结合过程。
心磷脂（CL）增强Bcl-2对Bax寡聚体的膜表面锚定
线粒体特异性脂质CL在凋亡过程中起着关键作用，它促进Bax募集至MOM并使其穿孔。在没有Bcl-2的情况下，CL的存在加速并放大了Bax的穿孔活性。本研究使用了含10% CL的Bcl-2/POPC/CL SLB，以研究在存在促孔CL的情况下Bcl-2对Bax的抑制效果。
研究发现，含CL的SLB中的Bcl-2以与仅含POPC双层相似的方式隔离Bax。只有当同时存在促凋亡的CL（10% mol/mol脂质）和相对较低含量的抗凋亡Bcl-2（6%体积分数）时，才观察到Bcl-2和CL对Bax的竞争，导致Bax/Bcl-2复合物和Bax/脂质簇（穿孔后）的混合物出现在双层表面。而SLB中较大的Bcl-2体积分数则导致Bax寡聚体仅出现在POPC/CL/Bcl-2 SLB表面。与POPC/Bcl-2 SLB一样，Bcl-2含量与双层表面Bax寡聚体的体积分数之间存在直接相关性。与不含CL的POPC/Bcl-2表面上的等效Bax寡聚体相比，这些Bax层的分布与SLB表面的关联更紧密。这一观察结果，结合缺乏膜嵌入Bax分布的情况，表明CL可能在Bcl-2/Bax复合物形成中起作用，可能迫使Bax寡聚化沿着膜表面进行，而不是像在Bcl-2/POPC系统中观察到的那样远离其表面进入溶液。
讨论
本研究使用了一系列结构和生物物理技术来解析抗凋亡Bcl-2对促凋亡Bax与MOM模型相互作用的影响。分析表明，MOM模型中Bcl-2的存在阻止了Bax诱导的膜穿孔。Bax蛋白与双层表面的结合是一个两阶段过程：最初以单体形式结合，随后随时间寡聚化。发现结合到含Bcl-2的MOM模型上的Bax量与Bcl-2含量直接成正比，提示Bcl-2/Bax复合物的形成。
此处描述的膜嵌入Bcl-2对Bax的隔离可能反映了Bcl-2在体内（例如在Bcl-2过表达的癌细胞中）作用的关键特征，即抑制Bax启动凋亡性细胞死亡。长期以来，Bcl-2和Bax的异二聚化一直被假设为关键的凋亡阻断机制。在本研究描述的时间依赖性NR实验中，Bcl-2/Bax复合化以两个动力学可见的阶段发生。最初观察到Bcl-2/Bax异二聚体在模型膜上的形成，这是通过一个快速（约9分钟）的初始Bax结合发生的，随后形成Bcl-2/Bax 1:1复合物。这一隔离相互作用发生在膜水平，并可能阻止孔形成的开始。
我们观察到了Bax与含Bcl-2的SLB结合的较慢第二步。对最终稳态结构的NR表征显示，Bax的分布与Bax在含Bcl-2的SLB表面及其上方的寡聚化一致。Bax-Bax寡聚化先前已被表征为活性和非活性胞质Bax二聚体，并在没有Bcl-2的情况下在其孔形成中进一步观察到。外推这一观察结果到此处的发现表明，从膜结合的Bcl-2/Bax 1:1组装体开始，Bax可以暴露其核心结构域的部分，作为进一步Bax-Bax聚合的初始位点。从而，将Bax寡聚化成远离膜的有序结构可防止孔形成。尽管本研究中Bax相对于Bcl-2大量过剩，但只有在膜中Bcl-2含量低时，才观察到脂质去除以及因此导致的孔形成。然而，在存在足够Bcl-2的情况下，尽管在水相滴定过程中Bax过剩，但未观察到Bax诱导的膜损伤。因此可以推测，这种Bcl-2诱导的Bax寡聚化不仅可能在Bcl-2高过表达的肿瘤中起作用，也可能在Bcl-2水平略有升高的肿瘤中起作用。
还可以推测，Bcl-2过表达的癌细胞能够通过Bcl-2介导的Bax寡聚化使其远离膜以避免孔形成，从而在存在过量激活Bax的情况下抵抗凋亡启动。可以假设，健康细胞可能通过涉及Bcl-xL和Bcl-2家族其他成员的机制，将瞬时Bcl-2结合的Bax重新易位到细胞质中，并将其转化为非活性的可溶状态。在癌细胞中，这种机制可能与通过蛋白质降解或其他过程去除过量Bax相耦合。
此外，MOM的脂质组成在内源性凋亡中起作用。线粒体特异性阴离子脂质CL的存在显著增强了Bax在没有Bcl-2时的膜穿孔活性。然而，如此处所述，如果Bcl-2含量丰富，则发现Bax在膜表面聚集，并且孔形成被抑制，除非Bcl-2丰度低。由于在含CL和不含CL的膜系统中，Bcl-2隔离Bax的主要特征相似，我们建议Bcl-2和Bax之间的主要结合点必须位于双层界面附近。
结论
此处的研究结果为Bcl-2家族抗凋亡成员的细胞保护机制提供了结构证据。Bcl-2的过表达已在许多癌症中发现，它通过减少凋亡促进疾病增殖。在此，我们提供了在膜环境中获得的关于Bcl-2/Bax复合化在预防凋亡中作用的直接分子水平结构证据。我们发现，Bax的隔离可能不仅源于与Bcl-2的异二聚结合，还源于随后与自身的结合。
