5-HT2A受体变构调控新机制：25CN-NBx化合物通过W336“拨动开关”通路调控致幻与抗抑郁效应分离

《ACS Chemical Neuroscience》：Rewiring Receptor Activation: Mechanistic Insights into Toggle Switch Modulation by 25CN-NBx Compounds

本文通过分子动力学模拟与自由能计算，揭示了25CN-NBx衍生物通过其N-苄基上不同取代基调节5-HT2A受体中W336“拨动开关”残基构象的分子机制，并关联了其构象状态（正或负χ2二面角）与下游信号通路（Gq/11vs β-arrestin2）偏好及致幻效应的分离。这一发现为开发选择性靶向受体、副作用更少的神经精神疾病治疗药物提供了原子层面见解，并为研究其他GPCR（G蛋白偶联受体）的激活机制提供了可迁移的计算策略。

　　

引言：从致幻到治疗的科学探索

开发神经精神疾病的新疗法，关键在于深入理解致幻化合物的分子机制，特别是如何区分其致幻效应与快速、持久的抗抑郁效应。这一核心问题驱动着针对5-羟色胺2A受体（5-HT_2AR）的研究，该受体被认为是介导两种效应的关键分子。血清素能致幻剂来自多种化学型（如色胺、苯乙胺和麦角胺），能以不同的效价和效能激活5-HT_2AR。典型的5-HT_2AR激动剂同时激活G_q/11通路和β-arrestin2易位。近期基于结构的药物发现进展，推动了偏向性激动剂（biased agonist）的开发，这些化合物能够稳定受体构象，从而优先激活某一下游信号通路而非另一条。例如，有研究通过虚拟筛选发现某些化合物能在小鼠中产生抗抑郁样作用而无致幻特性，显示出偏向于G_q/11激活；而另一些研究则发现了偏向于β-arrestin2信号传导的化合物，同样具有抗抑郁效应而无致幻反应。

在开发靶向5-HT_2AR的新化学型过程中，源自麦司卡林和DOI（2，5-二甲氧基-4-碘苯丙胺）的化合物在构效关系上取得了显著进展。特别是，在乙胺结构域引入N-苄基，合成出了一类对5-HT_2AR具有显著亲和力和效力的化合物。其中，25CN-NBOH (1)对5-HT_2AR具有高结合亲和力。最近，25CN-NBOH (1)与5-HT_2AR的结合晶体结构得以解析，揭示了其与LSD结合结构不同的新结合模式，其2-OH基团深入插入正构结合口袋，与W336的吲哚环形成关键相互作用。W336被称为“拨动开关”，被认为在信号转导过程中控制G蛋白偶联受体的激活。

2023年的一项研究对多种25N-NBx化合物进行了探讨，证明在N-苄基上添加大体积基团会显著降低5-HT_2AR对G_q/11的效能，同时保留对β-arrestin2的效能。这些偏向于β-arrestin2的化合物显示出无致幻潜力。研究表明，当G_q/11激活效能超过70%时，小鼠中会观察到致幻效应；而单独激活β-arrestin2（如带有大体积取代基的25N-NBx化合物）则似乎不足以诱发此类效应。弱的G_q/11激活与W336的χ₂二面角负值之间呈现出相关性，这凸显了开发计算方案以预测N-苄基添加后拨动开关最稳定取向的重要性。

结果与讨论

分子动力学模拟：拨动开关的自发旋转

为验证(1)至(7)在正构结合口袋内的稳定性，对每种化合物进行了四次独立的1微秒生产模拟。配体相对于对齐的5-HT_2AR的RMSD显示，所有化合物在整个4微秒的模拟中都保持了初始姿态，紧密结合在口袋中，平均值约为1.5 ?。

值得注意的是，在(3)、(4)、(5)、(6)和25CN-NDBF (7)的动力学模拟过程中，χ₂(W336)二面角从初始的约60–80°自发跃迁至约-20°的负值。鉴于无配体结构中χ₂(W336)值约为100°（其吲哚核心朝向胞外域），而在与(1)结合的晶体结构中转变为约60°，本研究选择将χ₂(W336)作为伞形抽样模拟的反应坐标，以获得收敛的平均力势，并识别每种化合物最稳定的构象，旨在发现配体结构与结合姿态（尤其是W336的取向及其在特定生物通路激活中的潜在作用）之间的关系。

2A receptor for the 4 μs of MD simulations.">

2(W336) dihedral angle along the 4 μs of cMD simulation for (1)-(7).">

通过伞形抽样模拟识别两种拨动开关构象

伞形抽样模拟证实，在N-苄基上添加取代基，特别是大体积取代基（如(5)、(6)和(7)），会迫使拨动开关W336将其吲哚核心朝向受体内部，呈现负的χ₂(W336)值。

2(W336) dihedral angle for (1)-(7).">

从(1)开始，比较(2)、(3)和(4)，观察环上添加-2-OH、-2-OH-3-Me和-2-OH-5-MeO的效果。在(1)和(2)中，仅在χ₂(W336) = 60°处存在一个明显的最小值，添加-2-OH后在χ₂(W336) = -20°处PMF仅有微小变化。然而，在(3)中添加-2-OH-3-Me，则在χ₂(W336) = -20°处诱导形成了一个显著的第二个最小值，其能量比在χ₂(W336) = 60°处的最小值高11 kcal/mol。最后，在化合物(4)中添加-2-OH-5-MeO引起了PMF的显著变化，使得χ₂(W336) = -20°处的最小值与χ₂(W336) = 60°处的能量相同。实际上，-2-OH-3-Me和-2-OH-5-MeO的添加在实验上都显示出降低的G_q/11效能，表明这种活性降低与负的χ₂(W336)值以及拨动开关吲哚核心指向受体内部密切相关。

如前所述，受C_3′位添加导致G_q/11效能降低的启发，研究进一步探索了N-苄基环上的各种取代基，增加了分子延伸至正构结合口袋未知区域一侧的体积。对于(5)、(6)和新合成的化合物(7)（它们均表现出低G_q/11效能）的PMF分析显示，最小值出现在负的χ₂(W336)值。化合物(5)呈现出两个清晰的最小值，较深的在χ₂(W336) = 100°，另一个在χ₂(W336) = -15°，能量差仅2 kcal/mol。相反，(6)在χ₂(W336) = -30°处有最深的最小值，另一个在χ₂(W336) = 60°处，能量高出6 kcal/mol。最后，25CN-NDBF (7)呈现出明显不同的情况，在χ₂(W336) = 100°处有一个最小值（类似于25CN-N1-Nap (5)），但其能量比在χ₂(W336) = -5°处的全局最小值高16 kcal/mol。(7)的结合也表明，二苯并呋喃的添加在5-HT_2AR内侧被良好耐受，显示大体积取代基在该区域能被很好容纳。

结合自由能计算

N-苄基极性取代基的添加

5-HT_2AR与(1)结合的晶体结构揭示了2-OH取代基与受体TM3极性残基之间的氢键，这被认为有助于其亲和力增加。基于此，我们比较了未取代的N-苄基化合物(2)、-2-OH衍生物(1)，以及实验报道中对5-HT_2AR具有最高和最低亲和力的另外两种化合物(3)和(4)。我们的结果证实，化合物(3)表现出最有利的总结合自由能ΔG_tot，其次是(1)和(2)，而(4)的总结合自由能最不利，相对于亲和力最高的化合物相差9.6 kcal/mol。区分(3)结合的主要因素是其更有利的范德华相互作用能ΔG_vdw，表明-3-Me取代增强了疏水接触并稳定了正构结合口袋内的特定相互作用。相比之下，其他三种化合物的ΔG_vdw值非常相似，表明-2-OH和-5-OMe基团对口袋疏水环境的影响不大。

值得注意的是，(1)、(3)和(4)中的三种取代都导致原始库仑项ΔG_el相比未取代化合物(2)有所降低，后者要有利约10 kcal/mol。乍看之下，这似乎表明(2)与受体发生最强的静电相互作用。然而，这种明显优势很大程度上被其高昂的极性溶剂化惩罚ΔG_pol所抵消。相比之下，化合物(1)显示出稍弱的ΔG_el，但通过最低的去溶剂化惩罚得以补偿，从而产生最有利的净静电能量。化合物(3)和(4)处于中间状态：(3)承受适度的去溶剂化惩罚，而(4)的净静电贡献甚至略有不利，因为其-2-OH和-5-OMe基团与蛋白质的预期氢键益处未能超过去溶剂化的成本。总之，这些结果表明，决定有效静电贡献的是与蛋白质的库仑相互作用和去溶剂化能量之间的平衡，而非单独的某一项。非极性溶剂化能贡献ΔG_np在所有化合物中保持相似，在观察到的差异中作用较小。

各结合能项进一步分解为成对的配体-残基贡献。与晶体结构一致，所有主要相互作用在(1)中得以保留。有趣的是，(1)、(3)和(4)在S159处显示出比(2)稍弱的ΔG_el值，表明该位点的氢键可能与D155的盐桥部分竞争，从而降低了净静电贡献。这一观察补充了我们之前的分析，即化合物(1)、(3)和(4)付出了较低的去溶剂化惩罚，但并未获得更强的直接库仑相互作用。(3)中C_3′位的取代进一步解释了其优异的结合能力。-3-Me基团增强了范德华稳定作用，其贡献分布在疏水笼中的所有主要残基上。与化合物(4)一样，(3)也显示出与拨动开关残基W336相互作用的增强，这与我们的MD模拟中观察到的构象适应一致。这些结果证实，C_3′位的添加主要通过增强N-苄基环在芳香笼内的疏水堆积来提高对5-HT_2AR的亲和力。

N-苄基大体积取代基的添加

添加大体积取代基（如(5)、(6)和(7)）会导致ΔG_vdw增加，其中(7)增加最多，这在其最高的ΔG_tot中得以反映。对于(6)，静电相互作用更为有利，但它也承受最高的ΔG_pol惩罚，比其他两种化合物高出6 kcal/mol，导致最不利的ΔG_pol。成对的配体-残基自由能分解揭示了三种化合物之间相对相似的相互作用。然而，对于(7)，由于其二苯并呋喃取代基更深入地渗透到5-HT_2AR内部，ΔG_vdw值更有利，并且在口袋残基间分布更均匀。除了与TM6疏水笼（主要涉及W336、F339和F340）的相互作用外，这些相互作用还延伸到TM7的残基，特别是V366、G369和Y370，并且还包括与I163的烷基-π相互作用。I163是一个关键残基，参与了一个已知在受体激活过程中发生构象变化的保守基序。

与拨动开关相关的结合自由能

为进一步探究伞形抽样模拟中观察到的两个不同最小值的形成驱动力，我们进行了MMGBSA分析，将拨动开关W336视为配体，而蛋白质其余部分及化合物(7)视为受体。自由能计算的构象取自识别出自由能最小值的两个伞形抽样窗口对应的50 ns模拟中按等间距提取的几何结构。我们特别关注了化合物(7)的US模拟，因为它呈现出两个最小值之间最大的能量差异。这种方法使我们能够计算W336与系统其余部分之间的ΔG_tot，并将其分解为成对相互作用，以确定其稳定的关键组分。主要的能量差异体现在ΔG_vdw上，其有利于χ₂(W336) = -5°处的全局最小值，从而产生了更有利的ΔG_tot。ΔG_el和ΔG_pol同样有利于全局最小值，而ΔG_np在两种构象间保持不变。

成对结合自由能分解将F332确定为在χ₂(W336) = -5°和χ₂(W336) = 95°两种构象下稳定W336的主要贡献者，后者的ΔG_vdw稍强。对两种χ₂(W336)值对应US窗口中50 ns MD模拟的视觉检查显示了F332有趣的行为。在χ₂(W336) = -5°对应的窗口中，χ₂(F332)稳定在约-30°的构象；而在χ₂(W336) = 95°对应的窗口中，观察到χ₂(F332)发生大的位移变化，转向180°。此外，在两个最小值中，拨动开关主要通过ΔG_vdw相互作用与I163发生相互作用，但在动力学过程中未观察到该残基有明显的构象变化。F332和I163都被认为是解释变构变化如何沿受体传递的基序的一部分，这些结果强调了这些残基的重要性并量化了它们与拨动开关的相互作用。

2 dihedral angle of F332 (yellow) and W336 (blue) during the umbrella sampling window at χ₂(W336) = -5° (pink) and the umbrella sampling window at χ₂(W336) = 95° (light blue).">

结论

确定5-HT_2AR的哪条下游信号通路负责致幻化合物的致幻效应，对于开发神经精神疾病的新疗法至关重要。最近对一系列25CN-NBx衍生物的研究揭示了小鼠致幻效应与G_q/11通路激活水平之间的直接相关性，G_q/11效能超过70%的化合物始终会诱导类致幻行为。这种通路激活也与拨动开关W336的构象变化密切相关。本研究中，我们通过结合非偏置和伞形抽样MD模拟以及MMGBSA计算证明，拨动开关W336的稳定性和构象变化可以通过25CN-NBx化合物上不同的N-苄基取代基进行预测和调控。非偏置MD模拟表明，W336可以根据配体的N-苄基添加情况自然采取两种不同的构象，χ₂(W336)是与此构象变化相关的关键反应坐标。因此，我们采用伞形抽样对χ₂(W336)在-60°到120°范围内进行采样，发现向N-苄基添加大体积取代基会将χ₂(W336)的最小能量移至负值，导致W336的吲哚核心朝向5-HT_2AR的胞内区域。事实上，对于(5)、(6)和(7)（它们均表现出低G_q/11效能且缺乏致幻效应）的PMF分析显示，在负的χ₂(W336)值处存在明显的最小值，这证实了G_q/11信号传导减弱与拨动开关向内位移之间的相关性。MMGBSA结果与实验发现一致，表明在化合物(3)中添加-2-OH-3-Me基团显著增强了其对5-HT_2AR的亲和力，而在化合物(4)中添加-2-OH-5-MeO取代则导致亲和力最低。C_3′位的甲基似乎增加了电子密度，并促进了其与结合口袋疏水区域的更紧密契合，从而与周围残基产生更有利的ΔG_vdw相互作用。相比之下，C_5′位的甲氧基并未增强ΔG_el或ΔG_vdw，却显著增加了ΔG_pol惩罚。添加大体积取代基（如化合物(5)、(6)和(7)）整体上增强了范德华相互作用，反映在更有利（即更负）的ΔG_vdw值上。最后，我们证明了χ₂(W336)在负值下的稳定性与更强的ΔG_vdw相互作用相关，在此状态下，该残基直接与F332相互作用，将其稳定在一个独特的χ₂(F332)构象，并与I163形成牢固的接触。F332和I163都与5-HT_2AR的变构激活有关。这些发现为25CN-NBx类别中不同取代基如何稳定5-HT_2AR特定构象提供了原子层面的见解，并对研究涉及TM6拨动开关的GPCR激活机制具有更广泛的意义。