《ACS Applied Bio Materials》：Decellularized Dermis ECM-Based Melanoma-on-a-Chip Model with Integrated Lymphatic and Vascular Networks for High-Throughput Drug Testing
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这篇研究报道了一种创新的体外黑色素瘤模型。它整合了脱细胞真皮细胞外基质（dECM）、血管与淋巴管网络于商业化微流控芯片平台，成功模拟了肿瘤微环境。模型具备形成有腔血管结构的能力，并通过概念验证药物测试，证实了其作为高通量药物筛选平台的适用性，为研究黑色素瘤进展、肿瘤-血管相互作用及治疗响应提供了强大工具。
引言
开发针对恶性黑色素瘤的有效疗法仍是一项复杂的挑战，这需要能准确复制肿瘤微环境以研究转移和药物反应的模型。尽管体外模型因其可调性和可控性已成为重要工具，但将仿生细胞外基质和血管组件结合的系统更为复杂，因此仍具挑战性。恶性黑色素瘤虽然在早期可被有效切除，但一旦进入转移阶段则危及生命且难以治疗。其高转移潜能源于通过血液和淋巴管的双重转移途径。目前的治疗方案包括手术切除、免疫疗法、靶向疗法以及放疗或化疗。然而，转移性黑色素瘤的治疗具有挑战性，因为大多数患者最终会对靶向疗法和免疫疗法产生耐药性。建立能够精确模拟肿瘤微环境的体外模型对于研究治疗耐药机制和筛选药物至关重要。本研究旨在探讨脱细胞细胞外基质作为肿瘤微环境基质在高通量血管化实体转移性黑色素瘤模型中的潜力，该模型同时包含模拟血液和淋巴管的腔室。
实验部分
本研究选用了商业化的OrganoPlate Graft微流控平台，因其重力驱动平衡技术可维持层流，无需泵和管道，适合各种通量需求。核心材料包括脱细胞真皮细胞外基质水凝胶和I型大鼠尾胶原作为参照。使用的细胞包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、从间充质干细胞分化的淋巴内皮祖细胞（LEPCs）、黑色素瘤细胞系（451Lu和WM164）以及人真皮成纤维细胞（HDFs）。
细胞培养方面，成纤维细胞使用DMEM培养基，黑色素瘤细胞使用肿瘤专用培养基（TSM），内皮细胞使用EGM-2培养基。通过离心法在超低吸附96孔板中制备三培养（451Lu、WM164和HDF以1:1:2比例混合）黑色素瘤球体。
芯片加载与培养流程如下：将dECM或胶原凝胶注入芯片的细胞外基质腔室，利用Phase-Guide技术在凝胶与灌注通道界面形成半月面。随后将HUVEC和LEPC细胞悬液分别接种于两个平行灌注通道的入口，通过毛细作用使其沿Phase-Guide贴附于凝胶界面。确认细胞贴附后，添加培养基，并将芯片置于改良的摇床平台上，以7°倾角、8分钟间隔进行摇摆，从而产生双向平均流速约为1 μL/min的连续灌注流。静态培养条件则保持芯片平放。
血管生成诱导在细胞形成融合单层后（约接种后24小时）进行，通过向移植腔室中添加含有促血管生成因子（如VEGF、S1p、PMA）的“出芽鸡尾酒”来诱导HUVEC和LEPC向凝胶内出芽和迁移。
分析检测方法包括免疫荧光染色（标记物：黑色素瘤细胞S100B、血管CD31、淋巴管PDPN）、屏障完整性实验（使用FITC-葡聚糖评估管腔密闭性）以及药物测试实验（使用维莫非尼和恩考芬尼等BRAF抑制剂）。图像采集使用高内涵成像系统和共聚焦显微镜。统计分析使用GraphPad Prism软件，采用曼-惠特尼U检验，显著性水平设定为p < 0.05。
结果与讨论
三维细胞培养与淋巴内皮祖细胞分离
研究人员首先评估了球体形成条件，发现肿瘤专用培养基（TSM）能支持三种细胞在72小时内自发、均一地聚集，无需额外添加生长因子，形成的异型球体具有高度的机械稳定性。通过死活染色证实培养72小时后球体细胞存活率高。此外，通过流式细胞术和三维管形成实验证实，从间充质干细胞分化而来的淋巴内皮祖细胞成功表达淋巴管标志物PDPN，并能在三维培养中形成网络样结构。
血管与淋巴管形成
利用OrganoPlate技术，将HUVEC和LEPC分别接种于两个平行通道，使其面向中央含有dECM的腔室生长。培养24小时后，形成了融合的单层，并观察到LEPC向dECM自发出芽或迁移。死活染色显示两种管形成细胞都具有高存活率。通过鬼笔环肽和DAPI染色，在24小时内即观察到两者均形成了有腔结构。免疫染色进一步证实HUVEC表达CD31，LEPC表达PDPN，且细胞间形成了连接。屏障完整性实验显示，FITC-葡聚糖信号被限制在HUVEC和LEPC通道的管腔内，表明其具有功能性紧密连接，而在无细胞的对照组中，荧光信号则扩散至整个微流控结构。
差异性的血管与淋巴管出芽形成
为研究细胞外基质成分对细胞迁移和血管生成的影响，比较了HUVEC和LEPC在胶原与dECM凝胶中的迁移表现。定量分析显示，两种细胞在dECM中都表现出更远的迁移距离和更长的出芽长度趋势，表明dECM的内在生化特性可能在细胞粘附和迁移中发挥作用。免疫染色显示，在dECM中，HUVEC形成了表达CD31的有腔结构，出芽出现在与凝胶接触的更高Z平面；LEPC则在有腔结构和出芽中均表达PDPN，出芽分布于不同Z平面。这些结果证明了dECM能够支持形成复杂且可灌注的血管和淋巴管结构。
用于药物测试的血管化黑色素瘤类肿瘤模型
在出芽形成后，将黑色素瘤球体精确放置于含有dECM的移植腔室中央。免疫染色用于评估内皮细胞、淋巴管细胞和球体之间的相互作用。结果显示，HUVEC和LEPC均向肿瘤球体迁移，并保持其有腔管状结构。值得注意的是，LEPC比HUVEC更快地与肿瘤球体内的癌细胞相互作用，表明黑色素瘤细胞介导的信号招募作用更强。黑色素瘤细胞也被观察到存在于球体核心之外，表明其对dECM底物有高亲和力。
作为概念验证，研究人员使用两种BRAF抑制剂——维莫非尼和恩考芬尼进行了药物测试。两种药物均通过HUVEC血管入口给药，模拟临床给药方式。细胞毒性测试结果显示，维莫非尼的细胞毒性与载体对照组相似，而恩考芬尼则表现出显著更强的细胞毒性。死活染色图像表明，恩考芬尼能有效靶向肿瘤球体内的细胞，同时保持模型其余部分（血管和出芽）的活力。此外，通过量化HUVEC单层的取向评估了血管内皮层的完整性，发现与载体对照组相比，暴露于维莫非尼和恩考芬尼后单层取向发生改变，且维莫非尼引起的改变更大。免疫染色分析还显示，治疗后球体形态发生改变，其圆形度从接种前的0.7显著降低至72小时后的0.3，反映了从紧凑球状团块向侵袭性形态的转变。对照组球体显示出更高的黑色素瘤标志物S100B总荧光强度，并与更大的细胞逃逸部分相关，表明对照组球体保持了更具增殖和迁移性的表型。
结论与展望
本研究开发的血管化体外三维模型结合了组织特异性仿生细胞外基质，在精准癌症研究和治疗方面具有巨大潜力。该恶性黑色素瘤肿瘤芯片模型利用了组织来源的脱细胞细胞外基质，提供了比传统I型胶原水凝胶更富含生物分子的环境。异型球体与血液、淋巴管网络在芯片内结合，实现了对肿瘤微环境更生理相关的重建。尽管目前使用的是内部开发的小鼠淋巴内皮祖细胞，其性能优于商业同类产品，但下一步关键是通过伦理委员会批准，使用人源材料验证这些发现。未来策略将包括用人类脱细胞细胞外基质替换猪源脱细胞细胞外基质，并纳入患者来源的肿瘤类器官。尽管如此，该模型在工业应用中仍具有重要价值，因为其具备高重复性和标准化优势。最后，作为概念验证，该模型在药物测试中的应用展示了其作为治疗筛选工具的潜力。
通过整合患者来源的肿瘤样本，此类模型可以定制化，精确复制个体肿瘤的结构和功能特征，从而更准确地评估肿瘤行为、疾病进展以及对治疗药物的反应。这些模型不仅可作为药物筛选的强大平台，也可作为临床医生的有价值的工具，用于预测患者特异性治疗疗效，并基于个体癌症的独特分子和细胞特征优化治疗策略。最终，使用此类先进的体外系统可以增强精准医疗，最大限度地减少试错性治疗方法，并改善患者的预后和生活质量。
