溶解氧依赖型镰状红细胞磁泳分离：基于磁性层析柱的原理验证研究

《ACS Measurement Science Au》：Dissolved Oxygen-Dependent Magnetophoresis of Sickle Red Blood Cells and Proof-of-Concept Separation Using a Magnetic Column

本文深入探讨了镰状细胞病(SCD)中红细胞的磁学特性及其在细胞分离技术中的应用前景。研究通过细胞追踪测速(CTV)技术，在不同氧分压(pO2)条件下系统测量了健康与镰状红细胞(RBCs)的磁泳迁移率，发现其在pO2为10毫米汞柱(mmHg)时存在显著差异，这源于镰状血红蛋白(HbS)与氧的亲和力降低所导致的氧合状态差异。研究进一步利用磁激活细胞分选(MACS)技术，在空气饱和条件下进行了概念验证性分离实验。结果表明，磁泳技术能够基于红细胞内血红蛋白的氧化状态对其进行区分和富集，为解决镰状细胞病输血治疗中健康供体红细胞浪费严重、供体资源紧缺等临床难题，提供了一种潜在的无标记、高效率分离新策略。

　　

实验方法

本研究使用的血液样本来源于健康供体(HD)和确诊的镰状细胞病(SCD)患者。通过离心洗涤从全血中分离出红细胞，并使用库尔特计数器测定细胞浓度和大小分布。

为探究氧分压的影响，研究团队设计了一套系统，通过向样本室中通入氮气和空气的混合气体，并利用不透氧的管路将样本输送至细胞追踪测速仪(CTV)的磁力腔室，以实现对红细胞悬液溶解氧浓度(pO₂)的精确控制和监测，测量范围覆盖0至160毫米汞柱。

细胞追踪测速(CTV)是本研究的核心技术。该系统将含有细胞的玻璃微通道置于由N52钕磁铁和软钢构成的特定磁场中。通过显微摄像头实时捕捉细胞在磁场和重力场共同作用下的运动轨迹，利用ImageJ FIJI的TrackMate插件和内部开发的MATLAB代码，计算出每个细胞在磁场梯度作用下的磁诱导速度(u_m)和重力沉降速度(u_s)，从而定量分析其磁泳行为。

分离实验则在空气饱和条件下进行，使用米尔tenyi生物技术公司的磁激活细胞分选(MACS) LS型层析柱，结合Halbach磁铁阵列产生磁场。将一定浓度的红细胞悬液(“进样”)以恒定流速泵入已预平衡的层析柱。在磁场存在下，具有较强磁性的细胞被柱内的铁磁性填料捕获，而磁性较弱的细胞则被洗脱液冲出，分别收集为“捕获”和“洗脱”组分。作为对照，实验也设置了无磁铁条件下的分离流程。分离后的各组细胞再次通过CTV和库尔特计数器进行磁泳迁移率和浓度的分析。

研究结果

磁泳迁移率随氧分压的变化

研究首先通过CTV技术，在单细胞水平上测定了不同氧分压下健康与镰状红细胞的磁泳迁移率和沉降速度。结果表明，无论是健康红细胞还是镰状红细胞，其磁泳迁移率均随氧分压降低而增加，这与血红蛋白脱氧后磁矩增大的理论预期一致。此外，镰状红细胞在相同氧分压下的沉降速度普遍低于健康红细胞。

为量化分析这种依赖关系，研究团队将实验数据与磁泳-希尔方程(Magnetophoretic Hill Equation)进行拟合，该方程结合了控制顺磁性颗粒在悬浮液中磁泳的基本物理原理和描述溶解氧-血红蛋白氧合平衡的经典模型。通过非线性最小二乘回归，获得了每个样本的希尔方程拟合参数，包括K_HbO2、n和C_HbV_RBC/D_RBC，证明了CTV技术能够在单细胞层面测量氧合血红蛋白的解离平衡参数。

镰状与健康红细胞的磁学差异

在关键的氧分压对比实验中，研究发现在pO₂为10毫米汞柱时，镰状红细胞的磁泳迁移率显著高于健康红细胞(p < 0.05)，而在其他测试氧分压(5、15、20 mmHg)下则未观察到显著差异。这一结果与镰状红细胞氧合血红蛋白解离曲线“右移”(即氧亲和力降低)的已知生理特征相符。由于红细胞的磁化率直接与其血红蛋白的氧饱和度相关，因此在血红蛋白处于部分氧合状态(既非完全脱氧也非完全氧合)的中等氧分压下，这种差异最为明显。

磁性层析柱分离的概念验证

基于上述发现，研究在空气饱和(pO₂≈ 160 mmHg，相当于21%氧浓度)和18%氧饱和度两种条件下，使用MACS LS层析柱对镰状红细胞样本进行了初步分离。结果表明，在两种条件下，“捕获”组分的红细胞整体磁泳迁移率均高于“进样”组分，提示该方法能够富集氧亲和力较低(即磁性更强)的细胞。进一步比较发现，在18%氧饱和度下捕获的细胞，其磁泳迁移率显著高于21%条件下捕获的细胞，再次验证了降低氧分压可增强红细胞磁矩的结论。

随后，研究对比了健康与镰状红细胞样本在空气饱和条件下经磁性层析柱分离后的情况。数据显示，镰状红细胞样本中被磁性捕获的细胞比例显著高于健康样本。然而，对分离后各组细胞进行单细胞磁泳分析时，发现了一个复杂现象：在健康样本中，有磁铁条件下捕获的细胞具有显著更高的磁泳迁移率，这可能归因于其中富集了约占健康红细胞总数1%的高铁血红蛋白红细胞，这类细胞因含有三价铁离子而具有顺磁性。相反，在镰状红细胞样本中，无论有无磁铁，其“捕获”组分的平均磁泳迁移率均显著低于“洗脱”和“进样”组分，甚至低于理论上的氧合红细胞值，表现出抗磁性。这提示在空气饱和条件下，镰状红细胞的捕获可能不仅依赖于磁性，细胞与柱内填料间的粘附作用也扮演了重要角色。

综合对比所有组分的磁泳迁移率，镰状红细胞的“进样”细胞磁泳迁移率高于健康红细胞，这与镰状细胞氧亲和力低导致磁矩增大的预期一致。而在有磁铁条件下分离时，镰状样本的“洗脱”细胞磁性高于健康样本的对应组分，但其“捕获”细胞的磁性却低于健康样本的捕获细胞，进一步支持了在空气饱和条件下，镰状红细胞的捕获机制中粘附作用占主导的推断。

讨论与展望

本研究的核心发现是，镰状红细胞与健康红细胞在磁学特性上的差异，根植于二者血红蛋白氧合平衡的根本不同。实验证实，在特定氧分压(如10 mmHg)下，镰状红细胞表现出更强的顺磁性，这为开发基于磁性的无标记细胞分离技术提供了理论依据。这种技术若能应用于临床，例如从镰状细胞病患者进行红细胞置换术产生的废弃血浆产品中特异性分离并去除镰状红细胞，将有望大幅减少每次治疗所需的供体红细胞单位数(从通常的6-10单位降至3单位以下)，并降低患者发生同种异体免疫反应的风险，具有重要的临床转化潜力。

当然，本研究也存在一些局限性。首先是氧分压控制精度有待提高，实验中的波动可能影响测量的可重复性。其次，采用的希尔方程模型是对氧合血红蛋白解离过程的简化，虽然参数物理意义明确且广泛应用，但在描述低氧分压下的结合细节时，不如阿黛尔(Adair)四步结合模型精确。未来的研究可以通过自动化气体控制和实时反馈系统来提升氧分压的稳定性。

关于磁性分离实验，在空气饱和条件下，镰状红细胞的捕获机制似乎更复杂，涉及磁性和粘附的共同作用。未来需要进一步量化这两种因素的贡献，例如通过将CTV测得的磁泳速度与红细胞表面粘附蛋白的表达水平进行关联分析。此外，实验中发现部分红细胞（尤其是镰状红细胞）可能滞留在层析柱内未被洗脱，优化缓冲液成分(如添加乙二胺四乙酸或牛血清蛋白)以及通过计算机模拟优化层析柱的填料结构、磁场分布和流体动力学条件，是提高捕获效率和减少细胞损失的关键方向。

最后，结合成像流式细胞术等补充技术，分析红细胞的形态和表面标志物(如反映细胞年龄的CD47和反映网织红细胞的CD71)，并利用机器学习工具，将能更全面地解析红细胞异质性，与磁学方法相辅相成，共同推动对镰状细胞病理生理学的深入理解和更精准的诊疗技术发展。