《ACS Nano》：Multiscale Simulations and Cryo-Electron Microscopy Reveal the Transition Pathway of Dengue Virus-like Particle Nanoassembly
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本文推荐：利用冷冻电镜和多尺度分子动力学模拟，首次解析了登革热病毒样颗粒（VLP）在成熟过程中的纳米级结构转变，揭示了其从“刺突状”前体到“光滑状”成熟体的“滑动-旋转”重排机制（T= 1），为理解病毒组装动力学及设计更安全有效的疫苗提供了关键结构动力学框架。
Establishment of a Stable Cell Clone Continuously Releasing prM-E Containing VLPs
为建立更高效的生产系统，研究者在前期工作的基础上，构建了一个能够持续分泌未成熟登革2型病毒样颗粒（imD2VLP）的哺乳动物细胞克隆。通过将中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞转染一种编码登革病毒prM–E蛋白的cDNA构建体，并突变其弗林蛋白酶（furin）切割位点，成功抑制了prM的加工，促进了imD2VLP的组装。透射电镜（TEM）观察显示，在细胞质膜附近存在电子致密的球形颗粒。抗原捕获ELISA检测证实，工程化的CHO-K1克隆能够在连续收获的培养上清中持续分泌E抗原，表明其可连续释放imD2VLPs。研究进一步通过液相色谱-质谱（LC–MS）测定了纯化imD2VLPs的脂质组成，发现其主要脂类为二酰甘油（DG）和游离脂肪酸（FA），并含有少量磷脂酰胆碱（PC）和氧化脂肪酸（OxFA），且不饱和酰基链占主导。这些脂质组学数据为后续构建粗粒化（CG）模拟的囊泡模型提供了关键参数。
Characterization of imD2VLPs
对imD2VLPs进行进一步表征，通过蔗糖梯度离心纯化并进行冷冻电镜分析。冷冻电镜图像显示，浓缩的imD2VLPs呈单分散状态，表面比成熟的D2VLPs（mD2VLPs）更粗糙，且尺寸小于未成熟的黄病毒毒粒。无需参照的二维分类根据形态和大小将颗粒分为三个主要群体：约76%的颗粒具有围绕近乎球形脂质双层的径向分布外围密度；约22%的颗粒具有表面不规则和非球形双层；约2%的为直径约40–52 nm的双层膜囊泡。对主要群体的冷冻电镜三维重构达到了约9.2 ?的平均分辨率，揭示了多层结构，在T= 1排列下显示出20个显著的刺突。这些刺突状VLP直径约35 nm。将未成熟DENV-2毒粒（PDB：4B03）的三聚体prM–E进行刚体拟合至密度图中，结果表明每个刺突由三个prM–E异源二聚体组成，并被三个pr结构域覆盖，呈现局部的3重对称性。在此拟合方向上，被切割的pr肽形成了一个覆盖E刺突顶端的“帽”状结构，而融合环近端区域（DII）和大部分DIII朝向刺突内部、pr帽的下方。这一结构特征与之前观察到的、imD2VLPs引发的融合环特异性和DIII构象非依赖性抗体水平较低的现象一致，为后续分析晶格几何和过程相关特征提供了结构基础。
Coarse-Grained Simulations Reveal Intrinsic Dynamics of imD2VLPs and Lipid Composition-Specific Remodeling of Nanoassemblies
为探索imD2VLPs的内在动力学，研究者构建了多个包含20个prM-E蛋白三聚体原体的完整imD2VLP粗粒化模型。这些模型被嵌入根据冷冻电镜密度图定位的、直径约210 ?的脂质囊泡中。模拟采用了两种基于实验数据的脂质组成：一种是磷脂（PL）主导的囊泡（VLPPL），含有POPC:POPE:POPS（60:30:10）；另一种是二酰甘油（DG）主导的囊泡（VLPDG），含有DG:SAPC:FA（56:28:6）。每种脂质组成又设定了两种不同的总脂质分子数，共得到四个系统。对每个系统进行了长时间尺度的平衡和生产模拟。分析所有蛋白主链珠的均方根偏差（RMSD）发现，VLPPL构建体比VLPDG系统更稳定，且脂质分子数较少的系统（VLPPL-2和VLPDG-2）倾向于更稳定，其中VLPPL-2最为稳定。在VLPDG模拟中，所有含DG的VLP系统均观察到脂质双分子层间形成脂质凸起（脂质透镜）。模拟的最终构象显示，VLPPL-1呈椭球形，而VLPPL-2呈球形，这与冷冻电镜图中观察到的构象异质性一致，表明脂质分子数是影响形态的因素之一。对茎螺旋（SH）和跨膜（TM）区域动态的分析显示，不同VLPPL系统中这些区域的溶剂可及表面积（SASA）以及与脂质包膜的接触数存在显著差异，表明SH和TM区域呈现异质、独立的取向，其密度可能在冷冻电镜重构过程中被平均化，导致这些区域的分辨率较弱或未被解析。主成分分析（PCA）显示，与VLPPL-2相比，VLPPL-1发生了幅度更大的结构变化，并伴有球形形状的丧失和更多的pr分子解离。模拟还显示，带负电的磷脂酰丝氨酸（POPS）与E蛋白SHTM区域之间存在强烈的相互作用，有助于在模型范围内稳定未成熟颗粒。在低pH条件下，PS磷酸基团的部分质子化会削弱这些相互作用，可能促进向成熟状态的重组。此外，与成熟状态相比，未成熟模拟轨迹中E蛋白的DII和DIII结构域显示出更高的溶剂可及性，表明融合环表位（FLE）等可能引起抗体依赖增强（ADE）的表位暴露更显著。
Targeted Molecular Dynamics (TMD) Simulations Explored Sterically Feasible Rearrangements Associated with VLP Maturation
与DENV毒粒类似，imD2VLPs在成熟过程中预期会发生大规模构象变化，即从具有20个三聚体prM–E刺突的刺突状T= 1状态，转变为具有30个E-E二聚体（M蛋白位于E胞外域下方）的光滑状T= 1状态。为探索与VLP成熟过程兼容的、空间位阻允许的重排方式，研究者采用了靶向分子动力学（TMD）模拟，将未成熟三聚体状态偏向引导至光滑的二聚体成熟状态。通过施加不同强度的RMSD偏置势能常数进行模拟，所有TMD模拟均显示，从三聚体刺突状态到二聚体光滑状态的构象转变可以实现，且E蛋白单体间无空间位阻冲突，同时颗粒保持对称形状。脂质包膜的直径在转变过程中逐渐变化，与实验值一致。TMD模拟证明了通过“滑动-旋转”运动从三聚体状态转变为二聚体状态的空间可行性，这与近期基于静态终点结构提出的DENV成熟模型一致。为了量化这种滑动和旋转运动，研究者计算了三个特征角度（?、Φ和δ）在模拟过程中的变化。角度?的变化显示，在转变过程中，E二聚体执行了类似“剪刀”的运动。角度Φ逐渐减小，角度δ则显示每个E蛋白单体相对于初始未成熟状态的方向逐渐改变。所有TMD模拟最终状态的平均?和Φ值与成熟VLP结构具有可比性。此外，对pr结构域与E蛋白DII之间最小距离的分析表明，大多数prM–DII对在整个转变过程中保持接触，只有偶尔的位移事件。在TMD模拟中，脱离E蛋白的pr分子数量与无偏MD模拟结果一致，表明观察到的重排主要由纳米组件内的几何兼容性决定。为了评估导向结构的机械稳定性，研究者在独立TMD模拟的最终构象基础上进行了无约束模拟，发现蛋白壳保持接近目标成熟构型，脂质包膜表现出稳定的平均半径和球形度，表明在去除偏置力后，由转向诱导的脂质重排不会导致膜持续失稳。
Empty Cryo-EM Density Maps Consistent with Dynamic Lipids and N-Glycans
在平衡模拟中，无论脂质组成和数量如何，所有模拟都观察到一些脂质分子会自发地、可逆地从球形脂质囊泡发生瞬时的突起事件，且通常位于5重对称轴附近。仔细检查冷冻电镜密度图，在所有5重轴处都一致观察到从脂质囊泡密度中出现的低分辨率密度特征。该特征在独立精修的两个半图中是可重现的，并且在使用软掩模的局部分类重构中也存在，表明其并非重构伪影，而是反映了可变占据的、与膜相关的特征。局部分辨率估计显示该位置的分辨率低于周围的蛋白壳，这与该位置的序度降低和/或异质性占据一致。时间平均的三维脂质密度图显示，向外的形变优先定位于5重顶点附近，这与冷冻电镜半图中观察到的可重现膜邻近密度相匹配。第二个未占据的冷冻电镜密度区域出现在将原子级VLP模型拟合到实验图之后。在N67和N153糖基化位点附近的区域存在未指认的密度。研究者根据实验信息为每个蛋白三聚体的N67和N153位点建模了糖链，这些建模的糖链与先前未指认的密度有大量重叠。将糖基化的三聚体prM-E蛋白嵌入含DG:PC:FA的脂质双层进行的全原子MD模拟显示，N67和N153位点的糖链具有高度动态性，占据较大的平均体积。综上所述，MD观察结果与冷冻电镜图谱分析共同支持将重构中先前未指认的密度解释为源于5重轴附近瞬时的、异质性占据的脂质突起以及N67和N153位点构象动态的N-聚糖。
Discussion of Structural and Simulation Findings
本研究在前述工作的基础上，解析了imD2VLPs的结构，并表征了与成熟相关的、空间上可行的大规模构象重排，以及支配颗粒稳定性的内在纳米力学。核心问题在于，高尔基体反面膜囊网络（TGN）中的低pH如何诱导prM–E刺突发生必要的构象重排。尽管约9.2 ?分辨率的冷冻电镜图谱限制了原子水平的解读，但将冷冻电镜数据与CG模拟相结合，为VLP成熟的动态特性提供了关键见解。模拟证明了在从未成熟三聚体状态向成熟二聚体状态转变过程中，E蛋白原体发生“滑动-旋转”运动的空间可行性，为连接两种纳米结构提供了合理的结构桥梁。鉴于未成熟颗粒与体内ADE相关，对这种空间可行重排的结构描述可能有助于为未来的免疫原设计提出假设。黄病毒成熟已提出了多种机制模型，本研究观察到的滑动-旋转运动增加了几何驱动、空间兼容性的视角，解释了未成熟组装体如何在T= 1的背景下进行无亚基碰撞的转变。未成熟登革毒粒和未成熟登革VLP的基本原体是相同的，都是刺突状的三聚体prM–E。然而，成熟毒粒呈现包含90个E二聚体、排列成30个筏结构的T= 3表面，而成熟登革VLP在T= 1壳上仅呈现30个E二聚体。因此，尽管未成熟毒粒刺突可能经历类似的滑动-旋转重排，但毒粒中更高的E二聚体拷贝数可能引入了额外的协同相互作用和晶格特异性约束。在成熟过程中，登革VLP和完整登革毒粒都经历了prM切割和低pH诱导的prM–E三聚体刺突重排，但由于两者组装成不同的二十面体组织，最终的结构转变存在显著差异。毒粒采用T= 3晶格，每个未成熟刺突位于二十面体3重轴，成熟后重新包装成三个平行E二聚体组成的筏结构。相比之下，登革VLP组装成T= 1晶格，缺乏形成延伸筏结构所需的长程对称性和位置约束。因此，当VLP刺突塌陷时，相邻单体重组为三个二聚体的局部三角形簇，而非连续的平面筏。结果，T= 1 VLP的结构变化不如T= 3毒粒那样剧烈和广泛，这与未成熟和成熟状态之间绝对角度偏差的分析结果一致。多尺度模拟使得研究者能够探究imD2VLPs的固有动力学，为空间可行性和包膜行为提供了定性见解。结果表明，imD2VLP的稳定性取决于脂质组成：富含磷脂且总脂质较少的囊泡能保持更球形和稳健的形态，而DG主导的包膜常产生可能影响膜完整性的脂质凸起。这些发现表明，脂质配方是规模化VLP生产的重要设计参数。另一个见解涉及糖链灵活性的作用。在对称轴附近观察到的弥散密度可能反映了异质性的脂质突起或灵活的糖链部分，而非缺失的蛋白组分或重构伪影。时间分辨分析进一步表明，脂质突起事件是罕见、瞬时且可逆的，在任何给定时间只涉及一小部分脂质群体，并且在无偏、TMD驱动和TMD后无约束条件下发生频率相当。这些观察支持了一种解释，即膜表现出受控的、与几何相关的可塑性，而非持续的紊乱或不稳定性。5重轴处的脂质突起及其与冷冻电镜密度的对应关系，突显了包膜水平的瞬时重塑行为，这可能与广谱抗病毒设计相关。本研究的应用的多尺度模拟框架遵循了先前在大型包膜病毒组装体上验证的方法。本研究存在几个局限性，应在解读和未来工作中予以注意。首先，TMD模拟探索了受实验终点约束的空间可行转变，但未捕获活化能或识别成熟途径中的限速步骤。其次，未成熟VLP结构的9.2 ?分辨率限制了侧链相互作用的原子水平解读。第三，虽然考察了多种脂质组成，但细胞膜环境可能包含此处未捕获的额外脂质种类和非对称分布。第四，VLP模拟不包含毒粒中存在的核衣壳核心，这可能对成熟施加额外的几何约束，因此限制从VLP直接外推至毒粒。未来结合冷冻电子断层扫描、亚断层图平均、更高分辨率的单颗粒重构、系统改变膜组成以及体内免疫原性测试的工作，对于进一步细化和验证这些模型将非常重要。
Conclusions
总而言之，本研究建立了一种用于生产imD2VLPs的哺乳动物途径，并阐明了它们的蛋白-脂质纳米笼在成熟过程中如何重组。结构-动力学框架揭示了脂质组成、脂质数量与四级结构稳定性之间与设计相关的关联，为驱动假设的登革VLP工程设计奠定了基础，包括旨在限制未成熟ADE相关展示状态的策略。这些发现共同建立了一个用于理解黄病毒VLP成熟的结构-动力学框架，并为未来的VLP工程提供了受实验约束的设计参数。
