胱抑素B可激活细胞穿透肽的开发：揭示动力学滞后与肿瘤靶向递送新策略

《ACS Pharmacology & Translational Science》：Development of Cathepsin B-Activatable Cell-Penetrating Peptides for Tumor Targeting

本期向读者推荐一项关于肿瘤靶向治疗的研究。文章系统报道了开发组织蛋白酶B(Cathepsin B)特异性激活的细胞穿透肽(ACPP)的研究过程。研究者通过底物序列C端延伸与N甲基化修饰，成功优化了底物的血清稳定性(t1/2从3.7分钟延长至23.4小时)与催化性能(kcat/Km)。研究首次揭示了组织蛋白酶B的内肽酶活性与动力学滞后现象有关，并通过分子对接阐明了P4′残基（如Val）在底物识别中的关键作用。基于此构建的荧光与64Cu标记ACPP，在U87MG胶质母细胞瘤细胞模型及小鼠异种移植模型中证实了其靶向激活与成像潜力，为基于蛋白酶的肿瘤诊疗提供了新思路。

　　

组织蛋白酶B内肽酶底物的设计、合成与动力学表征：内肽酶活性与动力学滞后相关

研究以已报道的组织蛋白酶B最佳羧基二肽酶底物——带有荧光供体2-氨基苯甲酰基(Abz)和猝灭剂2,4-二硝基苯基(Dnp)的六肽Abz-GIVRAK(Dnp)–OH为起点。通过将其C端酰胺化并延伸至七肽和八肽，研究人员发现当P4′位置（从裂解位点C端计数的第四个残基）为甘氨酸(Gly)时，底物转化遵循线性时间进程。然而，当P4′位置引入除甘氨酸外的其他氨基酸残基（如丝氨酸(Ser)或缬氨酸(Val)）时，组织蛋白酶B催化的转化速率曲线呈现凹形，即速率随时间增加，这指示了酶促反应的动力学滞后现象。系统性地将20种蛋白质源氨基酸引入八肽支架的P4′位置后发现，所有非甘氨酸残基均导致这种滞后行为。其中，缬氨酸(Val)在P4′位置时表现出最高的催化性能常数(k_cat/K_m= 245 mM^–1s^–1，pH 6.0)。进一步的构效关系研究表明，P4′位置的侧链范德华表面积与催化效率相关，中等大小的疏水侧链（如异丙基）最有利，过大或过小均会降低效率。特别值得注意的是，含有甘氨酸的底物（化合物4）数据点明显偏离该相关性，暗示其具有不同的底物结合模式。这种滞后行为被认为是由于组织蛋白酶B的“封闭”与“开放”构象（由其“阻断环”的构象变化所介导）之间的缓慢转变所致。对滞后曲线的动力学分析，首次估算出阻断环在封闭和开放状态的平均寿命分别为23.8分钟和5.7分钟。

选定底物与组织蛋白酶B的分子对接：P4′位置大于甘氨酸的残基需要开放的阻断环

为了探究滞后现象和P4′残基作用的分子基础，研究对P4′分别为甘氨酸（化合物4）和缬氨酸（化合物11）的两种八肽进行了分子对接。结果显示，两种底物都能与开放构象的酶结合。对于化合物11（P4′=Val），其缬氨酸侧链与酶Trp221残基之间存在显著的范德华接触，提示CH-π相互作用。模型表明，由于P2′位置庞大的Lys(Dnp)侧链无法被S2′口袋容纳，迫使肽链转向，使得P4′的Val残基能够弯曲进入S2′口袋，这得到构象灵活的P3′甘氨酸的支持。当对接至封闭构象的酶时，化合物4（P4′=Gly）能够更深地插入活性位点裂隙，其P3′羰基氧与阻断环上的His111形成氢键，而化合物11的结合则较浅，其催化羧基碳与活性位点半胱氨酸硫原子之间的距离更远，可能不利于形成共价复合物。这些发现为以下假设提供了结构基础：含有P4′≠Gly的底物需要阻断环从封闭态转变为开放态（表现为动力学滞后）才能被高效切割，而P4′=Gly的底物则可能以不同的模式与封闭态酶结合并发生反应。

组织蛋白酶B内肽酶底物在人血清中的抗蛋白水解稳定性优化：P1–P1′和P2′–P3′键是代谢降解的主要位点

为了应用于体内靶向递送，底物需要在血液循环中保持稳定。初始的八肽底物5（P4′=Ser）在人血清中的半衰期(t_1/2)仅为3.7分钟，主要降解位点是P1–P1′肽键（精氨酸(Arg)之后）。为增强稳定性，研究尝试了多种策略：(1) 替换P1位置的Arg，使用其类似物如高精氨酸(hArg)、正亮氨酸(nArg)、D型精氨酸(D-Arg)或瓜氨酸(Cit)；(2) 将N端的GIVR基序更换为文献中常见的组织蛋白酶B底物序列GFLG；(3) 对易被血清蛋白酶切割的P3′甘氨酸进行N甲基化。结果表明，单独替换P1残基可适度延长半衰期（如D-Arg类似物t_1/2=18分钟），但不足以保证体内应用。LC-MS分析揭示了P3′甘氨酸之后是另一个主要降解位点。将P3′甘氨酸N甲基化（引入肌氨酸，Sar）并结合GFLG序列（化合物41）或结合P1位修饰（如N^ω-乙基氨基甲酰化精氨酸，Arg(ec)）的GIVR序列（化合物40），可显著增强稳定性，使血清半衰期延长至>24小时。然而，N甲基化与GIVR序列的组合会损害底物与组织蛋白酶B的相互作用。最终，序列GFLGAK(Dnp)(NMe)GV被确定为兼顾良好催化性能（k_cat/K_m= 5.8 mM^–1s^–1）与高血清稳定性（t_1/2≈ 23.4小时）的优选底物。

针对组织蛋白酶S、L和K的底物选择性：为组织蛋白酶B和稳定性优化的八肽也能被其他肿瘤相关半胱氨酸组织蛋白酶切割

鉴于木瓜蛋白酶样半胱氨酸组织蛋白酶具有宽泛且重叠的底物特异性，研究测试了优化后的八肽底物（如化合物44， GFLG motif with Sar and Val）被组织蛋白酶S、L和K催化切割的效率。结果显示，对于大多数测试的八肽，组织蛋白酶K的催化效率最高，其次为组织蛋白酶L，组织蛋白酶S的催化效率与组织蛋白酶B相当或略高。几乎所有情况下，组织蛋白酶B的催化效率都低于其他几种组织蛋白酶。这主要归因于组织蛋白酶B的阻断环即使处于开放状态，也会对底物进入结合位点产生空间位阻。尽管缺乏对组织蛋白酶B的绝对选择性，但这对于基于ACPP的肿瘤靶向应用可能并非障碍，因为组织蛋白酶L和S也分别可由某些肿瘤细胞或肿瘤相关免疫细胞分泌，它们的共同作用甚至可能增强ACPP在肿瘤部位的激活与摄取。

将优化的稳定化底物整合入可激活细胞穿透肽

根据Tsien等人提出的通用设计，将优选底物序列GFLGAK(Dnp)(NMe)GV整合到ACPP中。该序列被置于N端的九聚D型谷氨酸(d-Glu)₉（抑制序列）和C端的九聚D型精氨酸(d-Arg)₉（细胞穿透序列，CPP）之间，并通过氨基己酸(Ahx)连接子连接以提供构象灵活性。在CPP序列之后，通过一个C端酰胺化的赖氨酸残基的侧链，分别连接荧光团TAMRA（化合物68）或螯合剂NODAGA用于⁶⁴Cu标记（化合物71）。作为对照，合成了以下探针：(1) 预激活的CPP（仅含底物的C端部分，化合物70和73）；(2) 不可激活的nACPP（用八聚D型丙氨酸完全取代底物序列，化合物69和72）；(3) 通过甲基化裂解位点（P1–P1′肽键）而失去活性的nACPP（化合物74）。所有肽均通过微波辅助固相肽合成法制备。

TAMRA偶联ACPP的细胞摄取研究

细胞系选择：U87MG细胞表达并分泌组织蛋白酶B

通过Western blot分析筛选表达组织蛋白酶B的肿瘤细胞系。人胶质母细胞瘤细胞系U87MG显示出显著的单链形式组织蛋白酶B表达，且细胞膜组分和培养上清中均检测到该酶，表明其具有细胞相关的酶活性。相比之下，虽然U251MG细胞在裂解液中酶含量高，但活细胞表面活性低；SW480细胞则表达其分泌型抑制剂胱抑素C(Cystatin C)。因此，选择U87MG作为组织蛋白酶B阳性细胞系。黑色素瘤细胞系Mel Juso基本不表达组织蛋白酶B，被选为阴性对照。

U87MG细胞对TAMRA-ACPP的摄取依赖于组织蛋白酶B的激活

共聚焦显微镜观察显示，TAMRA-ACPP（68）在U87MG细胞中呈现强烈的斑点状细胞内荧光信号，而在Mel Juso细胞中信号很弱。这种摄取可被广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64或选择性组织蛋白酶B抑制剂CA-074完全阻断。作为对照，预激活的TAMRA-CPP（70）在两种细胞系中均显示出强烈的组成型摄取，且不受蛋白酶抑制剂影响。而不可激活的TAMRA-nACPP（69）在两种细胞系中均仅显示微弱背景信号。这些结果证明，ACPP在U87MG细胞中的摄取依赖于组织蛋白酶B（可能还包括其他半胱氨酸组织蛋白酶）对其连接肽的切割激活。

放射性药物研究

⁶⁴Cu-NODAGA-ACPP在荷U87MG肿瘤小鼠体内的PET成像与生物分布

对荷U87MG胶质母细胞瘤异种移植瘤的裸鼠进行小动物PET成像。注射⁶⁴Cu-NODAGA-ACPP（71）后1小时，即可在肿瘤部位观察到明显的放射性摄取，并在24小时内持续积累。相比之下，预激活的⁶⁴Cu-NODAGA-CPP（73）在早期（1小时）肿瘤摄取更高，但在24小时时肿瘤滞留低于ACPP，且肝脏摄取非常高。不可激活的⁶⁴Cu-NODAGA-nACPP（72）在所有时间点的肿瘤摄取都非常低。

生物分布数据与药理学阻断实验

离体生物分布数据（注射后24小时）证实，⁶⁴Cu-NODAGA-ACPP在肿瘤中的摄取显著高于不可激活的对照探针。然而，通过共注射过量未标记的ACPP或使用不可激活的nACPP（72）进行竞争，并未能显著降低肿瘤放射性，提示这种摄取可能并非完全由特异性蛋白酶激活介导。为了更直接地评估组织蛋白酶B的作用，研究使用了在P1–P1′键进行N甲基化修饰的、不可切割的nACPP对照探针（74）。令人意外的是，⁶⁴Cu标记的74在肿瘤中的摄取与可激活的ACPP（71）没有显著差异。此外，在注射ACPP前用组织蛋白酶B抑制剂CA-074Me对小鼠进行预处理，也未能降低肿瘤放射性摄取。这些结果表明，尽管体外和细胞实验清晰证明了ACPP的组织蛋白酶B依赖性激活，但在该U87MG肿瘤小鼠模型中，体内肿瘤对ACPP及其不可切割类似物的滞留并非主要由肿瘤部位的组织蛋白酶B激活所贡献。作者讨论认为，ACPP在肿瘤血管系统中的非特异性滞留、肿瘤间质中带正电的CPP部分与负电组分的相互作用，以及其他因素，可能在体内肿瘤积累中扮演了比局部蛋白酶激活更重要的角色。这与之前一些关于放射性标记ACPP的研究结果一致，并凸显了将ACPP普遍用于放射诊疗学面临的局限性。

总之，该研究成功开发了具有高血清稳定性的组织蛋白酶B激活型细胞穿透肽，并首次揭示了该酶内肽酶活性与动力学滞后现象的关联及其结构基础。尽管体内实验表明肿瘤滞留机制复杂，但该工作为设计基于蛋白酶的智能递送系统提供了重要的分子工具和理论见解。