《Precision Chemistry》：Flavor-Enhancing Pentapeptide AGPNY from Tomato Proteins: Potential Dual-Targeting of Umami Receptors T1R1/T1R3 and GRM1 through Computational-Experimental Synergy
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本文建立了一种整合生物信息学虚拟酶解、机器学习（ML）预测、分子对接与分子动力学（MD）模拟（200 ns）及实验验证（电子舌、感官评定）的多维度筛选-验证框架，成功从番茄蛋白中精确鉴定出高效鲜味增强五肽AGPNY。该研究不仅为天然、安全的植物源风味增强剂发现提供了高精度方法学范式，也为其原子层面靶向鲜味受体T1R1/T1R3及代谢型谷氨酸受体1（GRM1）的双靶向机制提供了深入见解，对推动功能性食品添加剂的理性设计与健康饮食具有重要意义。
引言背景
鲜味作为一种基本的味觉模态，能够显著提升食物适口性，并允许减少钠盐用量，从而支持健康饮食。传统的增味剂味精（MSG）存在安全性及高钠含量的担忧，这使得研究焦点转向了鲜味肽。鲜味肽是蛋白来源的水解物，具有天然、安全的特性，且与味精相比可能具有更高的效力，且不伴随肥胖或心血管等健康风险。
鲜味的感知主要由异源二聚体G蛋白偶联受体（GPCRs）T1R1和T1R3介导。此外，近期的研究表明代谢型谷氨酸受体1（GRM1）也对鲜味感知有重要贡献。T1R1/T1R3和GRM1都具有一个保守的捕蝇草（VFT）结构域来捕获鲜味配体。虽然先前的研究已从动物源中鉴定了许多鲜味肽，但植物来源的替代品仍未被充分探索。番茄（Solanum lycopersicum）富含谷氨酸和多样化的蛋白质，是潜在高效鲜味肽的可持续但尚未开发的资源。
传统的鲜味肽发现方法通常费时费力且成本高昂。现代的计算方法，包括机器学习（ML）和分子对接，为高效筛选肽库提供了策略。分子动力学（MD）模拟则可进一步提供原子水平的见解，揭示肽与味觉受体之间的结合稳定性与相互作用机制。
材料与方法
本研究建立了多维度筛选-验证系统来鉴定番茄来源的鲜味肽。其工作流程整合了虚拟酶解、生物活性与安全性筛选、分子对接模拟及实验验证等多个阶段。
虚拟筛选
对来自NCBI数据库的番茄蛋白序列进行了虚拟酶解，生成639个二到六肽的肽库。随后，通过肽活性预测工具（PeptideRanker）、ADMET毒性预测、溶血性和水溶性预测（Peptide.bio）以及鲜味特异性机器学习模型（Mlp4Umami）进行系统筛选。最终，基于活性得分、安全性（无毒、溶血风险<10%、水溶性>60%）和预测的鲜味潜力（Mlp4Umami >0.5）等标准，筛选出15个具有高鲜味潜力的候选肽。
分子对接筛选
对15个候选肽与三个鲜味受体（T1R1, T1R3, GRM1）进行了分子对接分析，以评估结合相互作用。更高的对接能量绝对值表明对受体亚基更强的结合亲和力。同时，通过ITScoreAff对所有对接构象进行评分，并以热图形式可视化，其中暖色调表示更高的评分。基于对接能量和ITScoreAff值，AGPNY、PDQGGR、QGDAVW、DCGSIR这四个肽被优先选出进行进一步分析。
实验验证
电子舌分析：使用SA402B味觉传感系统对候选肽的鲜味强度及味觉轮廓进行表征。结果证实，四个计算筛选出的肽均检测到可辨的鲜味信号。实验得出的鲜味强度排序为：AGPNY > PDQGGR > DCGSIR > QGDAVW，与计算预测趋势基本一致。值得注意的是，AGPNY虽然显示出最强的鲜味响应，但也记录了较高的苦味和酸味响应值。这归因于电子舌传感器不同的灵敏度、未调节pH导致的肽电离产生的H+离子影响，以及从风味化学角度看，苦味与鲜味常存在协同效应，苦味氨基酸（如AGPNY中的Tyr）可作为调节剂通过调节受体相互作用来增强鲜味轮廓。
感官评价：由训练有素的小组（n=10）对合成肽的感官轮廓和味觉阈值进行评估。在1 mg/mL浓度下，所有肽均表现出鲜味特性，其中AGPNY获得最高的鲜味评分（4.10 ± 0.74）。通过逐步稀释法测定鲜味阈值，AGPNY展现出极低的鲜味阈值（0.0625 mg/mL），而PDQGGR和DCGSIR的阈值均为0.1250 mg/mL。与标准鲜味剂味精（阈值约0.3 mg/mL）相比，AGPNY的味觉检测效力高出约4.8倍，这严格验证了AGPNY是一种高生物活性的鲜味肽。
分子水平的作用机制研究
分子动力学模拟：对四个肽（AGPNY, PDQGGR, QGDAVW, DCGSIR）与三个目标受体蛋白（T1R1/T1R3异源二聚体和GRM1同源二聚体）形成的12个复合物体系进行了200 ns的分子动力学（MD）模拟，以阐明其相互作用的分子水平机制。
结合自由能与构象采样：采用MM/GBSA方法结合滑动窗口分析计算了12个体系的结合自由能。在所有体系中，静电成分（ΔGelec）始终是结合的主要驱动力，通常显著超过范德华力贡献（ΔGvdw）。这与短肽中带电末端和极性侧链（如Asp, Glu, Arg, Lys）在受体口袋内形成关键的盐桥和氢键相一致。
结合口袋特征与肽构象影响：对三个受体底物结合口袋表面积和体积的分析显示，口袋体积顺序为T1R1 > GRM1 > T1R3。肽的分子内相互作用（特别是N端和C端的相互作用）受受体结合口袋空间限制的调节。T1R3具有最受限的结合位点，有利于形成紧凑的四残基环状结构。GRM1具有中等大小的口袋，可容纳稍大的五残基环状构象。而T1R1更广阔的结合腔则更容易容纳开放的延伸构型或更大的环状结构。
关键的相互作用：
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T1R1-AGPNY: AGPNY形成环状构象，其N端和C端分别与受体结合位点内的关键残基Asp147和Arg277形成电荷-电荷相互作用，从而将肽锚定在结合凹槽中。
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T1R3-AGPNY: AGPNY同样形成环状构象，N端与结合口袋入口处的残基Glu148和Asp216结合，C端与Asn68形成氢键，使其靠近His145-Glu148功能簇。
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GRM1-AGPNY: AGPNY的N端和C端均暴露在溶剂中，C端由于酪氨酸侧链的空间位阻，与口袋外围的Arg71和Arg323形成中等强度的电荷-电荷相互作用，而N端则靠近Glu233形成静电相互作用。
肽的末端残基如果存在固有的空间位阻（例如N端脯氨酸），或其带电末端与带有相反电荷的短侧链靠得过近导致电荷中和，都会阻碍其深入中央的带电口袋，转而与口袋入口两侧的残基结合。在肽定位到受体后，当主要的静电锚定残基之间的距离超过临界阈值时，溶剂分子会插入其中，通过介电屏蔽和电荷极化效应减弱直接的电荷-电荷相互作用。然而，这种减弱会被肽和受体互补区域之间形成的其他非共价相互作用（氢键、范德华接触和疏水堆积）所补偿，这些次级相互作用逐渐稳定结合复合物，并在特定条件下成为结合亲和力的主要贡献者。
结论
本研究建立了一个结合生物信息学、机器学习和分子建模的多维度筛选与验证框架，用于从番茄蛋白中鉴定鲜味肽。发现了一个高潜力的五肽AGPNY，其展现出强烈的鲜味特征。电子舌分析证实AGPNY可引发显著的鲜味信号，其味觉阈值低至0.0625 mg/mL。分子对接和分子动力学模拟从原子层面揭示了其潜在的作用机制。计算数据提出了AGPNY与T1R1/T1R3异源二聚体和GRM1同源二聚体均能保持稳定相互作用的双结合模式假说。关键的结合基序和关键残基，如T1R1的Arg277，被鉴定为可能是稳定这些复合物所必需的。这些发现扩展了植物源鲜味肽的种类，并强调了使用番茄蛋白作为天然风味增强剂来源的可行性。AGPNY代表了在食品工业中用于减盐和清洁标签应用的一个有前景的候选物。
