《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Singlet Oxygen Generated by Quercetin and Gallic Acid Leads to Oxidative Fragmentation of Flavonols in Onions and Leek
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本综述系统性探讨了槲皮素和没食子酸在温和条件（37°C， pH 7，避光）下自发产生活性氧(1O?)，并导致洋葱和韭葱中黄酮醇发生氧化裂解的过程。研究揭示了1O?引发的化学淬灭机制（形成环状过氧化物中间体）和物理淬灭机制（形成甲醇加合物），并通过洋葱和韭葱样品验证了该反应在真实食品基质中的重要性，为理解食品加工过程中酚类物质的转化提供了新的化学视角。
引言
黄酮醇因其抗氧化、抗致癌、抗突变和抗炎等特性，在治疗神经退行性或心血管并发症等方面显示出潜力。作为植物的次级代谢产物，黄酮醇可帮助植物抵抗紫外线辐射、病原体或气候变化等生理胁迫。富含黄酮醇的植物包括Allium物种（如洋葱和韭葱），其中最常见的黄酮醇是槲皮素、山柰酚、杨梅素和异鼠李素，通常以O-糖苷形式存在。糖苷配基（苷元）的含量通常微不足道，但在食品加工等植物组织受损时会从糖苷中释放出来。槲皮素已显示出比其糖苷芦丁或其他黄酮醇（如山柰酚）更高的抗氧化活性。尽管已知其抗氧化特性，但其促氧化的一面也引起了关注。先前的研究已证实，即便在避光条件下，aspalathin和抗坏血酸也能产生活性氧(1O?)。研究进一步表明，1O?能引发二氢查耳酮的氧化重排和裂解。在二氢查耳酮中，仅aspalathin被证明能产生1O?，这种效应归因于其B环的儿茶酚结构。因此推测，其他具有儿茶酚取代B环的黄酮类化合物（如槲皮素）可能具有类似性质。据我们所知，黄酮醇在温和的温度和pH条件下、避光时内源性产生1O?尚未被证实。文献报道，槲皮素易被外源性1O?降解，主要裂解产物为酯类和苯甲酸，但所有情况下，1O?均为光化学产生。因此，本研究旨在表征黄酮醇产生1O?并诱导氧化裂解的能力，并证明该反应在食品的温和条件下能够进行。
材料与方法
所有化学品均采购自Sigma-Aldrich、Roth、ACROS Organics、Merck、Fluka和VWR Chemicals等公司，均为最高可用质量级别，实验均使用超纯水。苯甲酸或二氢肉桂酸通过加入亚硫酰氯在甲醇中回流搅拌进行甲酯化合成。1,4-二甲基萘-1,4-桥环过氧化物(DMN-EP)参照Heymann的方法基于光化学1O?产生合成，使用前通过1H-NMR进行组成分析。需氧条件下的根皮苷孵育在37°C、pH 7、避光的摇床中进行24小时，通过气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析裂解产物。1O?的检测通过在反应体系中加入9,10-二苯基蒽(DPA)作为特异性捕获探针，并通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析其桥环过氧化物产物。多酚（包括槲皮素、异槲皮素、芦丁、非瑟酮、鼠李素、异鼠李素、山柰酚、芹菜素等）和洋葱/韭葱的需氧孵育采用类似条件。脱氧条件下的孵育则在添加二亚乙基三胺五乙酸并通入氦气或氩气的体系中进行。通过制备型反相色谱从槲皮素与没食子酸的放大孵育体系中分离得到槲皮素-甲醇加合物。分析技术包括高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-DAD)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、高分辨质谱(HR-MS)和核磁共振波谱(NMR)。定量实验均进行三次重复，检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别按信噪比3和10计算。
结果与讨论
1O?引发的根皮苷降解
为深入研究1O?与黄酮类化合物的反应并扩展可产生1O?的酚类化合物谱系，我们采用了已建立的根皮苷氧化降解模型。在温和条件（37°C， pH 7，通气，避光）下孵育24小时后，通过定量根皮苷的1O?诱导裂解产物p-二氢香豆酸来间接衡量1O?的存在。结果显示，具有邻苯二酚或焦酚/没食子酰基化结构的化合物是有效的1O?源。其中，没食子酸和表没食子儿茶素没食子酸酯效果最为显著，分别导致3.15和3.24 mol %的根皮苷断裂。由于没食子酸在植物和食品中更为常见，因此被选为后续所有实验的1O?源。通过使用9,10-二苯基蒽(DPA)作为特异性捕获探针，直接鉴定了槲皮素和没食子酸孵育体系中产生的1O?桥环过氧化物，其结果与标准品一致。
1O?引发的槲皮素和山柰酚降解
我们首先关注了没食子酸诱导的1O?对槲皮素和山柰酚的降解，因为它们是蔬菜中最丰富的黄酮醇。在没食子酸存在下，槲皮素在孵育4小时后被完全消除，而原儿茶酸在24小时累积至25 mol%。值得注意的是，即使在没食子酸不存在的情况下，槲皮素也显示出明显的降解（24小时减少32 mol%）并伴有中等程度的原儿茶酸形成（7 mol%）。这证实了槲皮素本身在通气条件下可以内在地产生1O?，从而诱导其自身降解。另一方面，缺乏儿茶酚或焦酚结构的山柰酚，在没有没食子酸时几乎没有降解，也未监测到p-羟基苯甲酸。但在没食子酸存在下，其氧化断裂被诱导，在16小时内完全分解，并产生约7 mol%的p-羟基苯甲酸。在所有没食子酸参与的反应中，还鉴定出另一个羧酸为t-乌头酸。
1O?诱导黄酮-3-醇降解的机制研究
为阐明裂解机制，我们将实验扩展到具有不同取代模式的其他常见黄酮醇。Tournaire等人曾提出光化学产生1O?的机制，涉及1O?与2,3-C环双键发生[2+2]环加成，形成不稳定的二氧杂环丁烷，随后开环并失去一氧化碳，生成来自原A环的2,4,6-三羟基苯甲酸酯和来自原B环的羟基苯甲酸。然而，在本研究使用的水性孵育条件下，并未通过LC-MS发现此类酯结构，显然这些酯易于水解，裂解总是产生游离的2,4,6-三羟基苯甲酸。例如，在槲皮素孵育中验证了该酸的存在。同时，作为水-甲醇溶剂中的副产物，检测到了相应的甲酯，这证实了在1O?介导的黄酮醇裂解过程中存在酯中间体。例如，在槲皮素-没食子酸孵育中鉴定到了原儿茶酸甲酯。不同黄酮醇形成甲酯的比例差异很大。
研究表明，所提出的初始环加成形成桥环过氧化物的反应强烈受2,3-不饱和C环电子密度的控制。游离的3-OH官能团，以及B环的儿茶酚或氢醌醚结构，总是导致较高的裂解产率。缺乏3-OH取代的芹菜素、仅有单B环羟基化的山柰酚、以及3-O-糖基化的槲皮素衍生物（如异槲皮素和芦丁），其裂解产率均较低。为了明确1O?在反应中的必要性，首先在脱氧条件下进行槲皮素-没食子酸反应，裂解产率显著降低；然后在脱氧条件下使用DMN-EP代替没食子酸原位产生1O?，其产生的原儿茶酸水平几乎达到了需氧孵育的条件。这证实了1O?是反应的关键。
黄酮-3-醇在1O?存在下的裂解代表了一种活性氧的化学淬灭机制。另一种机制提出1O?加成到C环的C-2和C-4位，形成五元桥环过氧化物（图3，实线箭头）。这种环加成必然伴随3-OH和C-4羰基之间的氢转移，这在黄酮-3-醇中由于已知的C-3与C-4之间的氢螯合效应而极有可能发生。这种双环五元桥环过氧化物的分解已被证明会释放一氧化碳并产生羰基片段。实际上，在使用C-3位13C标记的槲皮素实验中，已证实其在光化学产生1O?处理下会从该特定位置释放一氧化碳。最终的酯在甲醇存在下水解为2,4,6-三羟基苯甲酸和羟基苯甲酸衍生物或其甲酯。
需要强调的是，所有关于黄酮醇化学的机制研究都是在（I）无水条件下（通常在纯甲醇中）和（II）紫外照射下进行的，以诱导化学和物理淬灭效应。而在本研究使用的模拟食品相关条件的温和温度、pH、避光、水性介质中，我们成功从槲皮素-没食子酸反应中分离出了C-2位甲醇缩醛加合物——2-甲氧基-3,3,5,7,3′,4′-六羟基黄烷酮（图3，表3）。该结构此前仅在辐照的甲醇溶液中通过LC-MS鉴定。因此，这强烈表明，在本研究使用的水性条件下，黄酮醇不仅可以通过化学淬灭内源性产生的1O?导致裂解，同时也能通过物理淬灭1O?诱导氧化。
洋葱样品中1O?诱导的黄酮-3-醇降解
为验证1O?介导的降解在食品中的相关性，我们在市售洋葱样品中进行了测试。选择红洋葱是因为其高槲皮素含量，且几乎全部以单糖苷和双糖苷形式存在。在孵育开始时检测到少量槲皮素苷元。糖苷模式与文献数据一致，其中槲皮素-3,4′-O-双葡萄糖苷和槲皮素-4′-O-单葡萄糖苷最为丰富。酶促水解在切碎后立即开始。槲皮素-3,4′-O-双葡萄糖苷在孵育的前4小时内迅速衰减，并在16小时后完全消除。与此同时，槲皮素-4′-O-单葡萄糖苷在6小时达到峰值，随后水解产生游离槲皮素。另一组小峰显示出与槲皮素衍生物类似的水解模式，通过LC-MS鉴定为异鼠李素的糖苷。在槲皮素从其糖苷中释放的同时，检测到原儿茶酸及其甲酯在24小时后达到约4.5 mg/kg鲜重。同样，也验证了源自异鼠李素氧化裂解的香草酸的形成，但水平低得多。为排除任何由高分子结构酶解形成的可能性，在脱氧条件下重复了孵育，未检测到其增加。因此，上述建立的黄酮醇的1O?诱导裂解显然也发生在常见的食品加工过程中。对于洋葱，占主导地位的槲皮素苷元首先在细胞完整性被破坏后通过水解释放，随后成为其自身儿茶酚结构产生的内源性1O?的目标，诱导裂解产生原儿茶酸，以及从释放的异鼠李素产生香草酸。由于具有B环氢醌甲醚结构的异鼠李素自身不能产生1O?，通过槲皮素-异鼠李素共孵育实验证明了两者间的因果关系，同时产生了原儿茶酸和香草酸。
韭葱样品中1O?诱导的黄酮醇降解
为了进一步扩展1O?引发的黄酮醇降解的重要性，对韭葱样品进行了类似处理。韭葱含有显著量的山柰酚糖苷。在本研究使用的市售韭葱样品中，从未检测到槲皮素或其相应的糖苷。定量上重要的山柰酚物种是各种3-O-单糖苷和双糖苷，部分被丙二酸和肉桂酸酯化。这应在加工诱导的水解过程中导致p-香豆酸、阿魏酸和咖啡酸的释放。在本研究中，LC-MS筛选证实，除了山柰酚，仅阿魏酸与预期的1O?引发的山柰酚裂解产物p-羟基苯甲酸一同形成。由于它们的酚类结构，山柰酚和阿魏酸都不能产生1O?。然而，没食子酸作为一种强效1O?源，被定量发现在24小时的孵育期间缓慢累积至0.5 mg/kg鲜重。韭葱中没食子酸的存在可归因于可水解单宁的水解释放。在脱氧条件下的孵育产生了相似水平的没食子酸释放，但p-羟基苯甲酸的产生量显著降低。因此，p-羟基苯甲酸的形成被归因于由没食子酸产生的1O?诱导了山柰酚的裂解。为突出这种关系，在韭葱中添加42.5 mg/kg鲜重的没食子酸进行孵育，并重新将pH从天然韭葱孵育的5.3调整至6.3，验证了p-羟基苯甲酸的强烈增加，最高达7.5 mg/kg鲜重。
总之，研究确立了在典型食品加工条件（中性pH的水性介质中、避光）下活性氧的产生及其后续反应。具有邻苯二酚或焦酚/没食子酰基化结构的所有三大类植物酚类物质（羟基苯甲酸类、肉桂酸类和黄酮类）都是有效的1O?源。模型反应表明，这种诱导的黄酮醇裂解产生羟基苯甲酸是一个主要结果，产率可达25 mol%。对洋葱和韭葱的研究首次证实，1O?引发的裂解确实在复杂的食品基质中进行。由于本研究完全不同于既定的光化学诱导1O?方法，这将推动后续研究，不仅包括其他植物酚类结构，也包括其他主要食品成分。
