《Bioscience Nanotechnology》：Discrete, oxidized multi-walled carbon nanotubes for efficient plasmid DNA transfection
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这篇原创性研究展示了一种新型的、稳定的氧化离散多壁碳纳米管（do-MWCNT）分散体系，它使用双表面活性剂（DSPE-PEG-NH2和270k MW bPEI）进行功能化，能够高效递送大尺寸质粒DNA（8.78 kb）。研究表明，该体系在转染效率上可比肩甚至超越商业化的脂质纳米颗粒Lipofectamine 3000，同时展现出更低的细胞毒性。这为基于碳纳米管的非病毒基因递送系统提供了一种有前景的优化策略，并探索了将其配方推广至单壁碳纳米管（SWCNT）的潜力。
文章内容归纳
引言
哺乳动物细胞的基因转染技术在推动医学与生物技术进步方面扮演着核心角色，例如在新型疗法开发、研究工具革新、疫苗研发及生物制造等领域。目前，脂质纳米颗粒（LNP）是最主流的商业化转染试剂，其市场庞大，但也存在局限性：对大尺寸质粒（如大于5 kb）的递送效率降低、可能影响细胞活力、可携带的生物分子类型有限，以及在储存和保质期方面存在挑战。因此，开发一种稳定、低毒、使用便捷且递送范围广的替代性转染方法显得尤为必要。
功能化、生物相容性良好的离散碳纳米管作为一种潜在的转染试剂已展现出前景。碳纳米管独特的物理化学性质使其能够结合包括质粒DNA在内的多种生物分子，但其转染潜力尚未完全实现，尤其是在与现有商业转染试剂（如LNP）的直接性能比较方面。
本研究旨在开发一种新型的氧化离散多壁碳纳米管（do-MWCNT）制剂，旨在最大程度降低毒性并提高转染效率。
材料与方法
本研究使用了由Molecular Rebar Design LLC提供的化学气相沉积法生产、经浓硝酸和高能分散法功能化的多壁碳纳米管（MWCNT）。其主要物理尺寸为长度约530纳米，外径13纳米，内径5纳米，平均壁数13层，外壁氧化率约为20%。
do-MWCNT分散液的制备：将6%湿饼状MWCNT分散于水中，使其固体含量不超过1%（重量）。首先加入初级表面活性剂DSPE-PEG-胺（2000 MW， Laysan Bio生产），涡旋混合后，进行30分钟的室温水浴超声以分散碳纳米管。随后加入分支型聚乙烯亚胺（bPEI， 270k MW， Sigma Aldrich生产），再进行90分钟的室温水浴超声。使用100万道尔顿截留分子量的透析膜过滤，以去除未结合的表面活性剂。过滤后的分散液经过高压灭菌灭菌，再超声120分钟，最后以20,000 g离心10分钟以去除大颗粒。
单壁碳纳米管（SWCNT）分散液：采用了与do-MWCNT相同的表面活性剂（DSPE-PEG-NH2和bPEI），但根据单壁管与多壁管的几何差异（如可接触表面积）对表面活性剂的配比进行了理论上的按粒子匹配比例的调整。在制备过程中，对SWCNT和水进行了更强烈的探针超声处理，以增加其有效表面积。
质粒与加载实验：研究中使用了pTRIOZ_hIgG1质粒，总大小为8.78 kb。通过琼脂糖凝胶电泳评估了不同分散液的DNA加载能力。标准转染剂量为20微克离散MWCNT分散体对应1微克质粒DNA，在4°C下孵育96小时，除非在特定实验中有所变动。
细胞实验：使用CHO-K1细胞系，在F-12K + 10% FBS培养基中培养。将细胞接种于12孔板后，加入转染试剂处理，通常孵育72小时后进行后续qPCR分析。在与Lipofectamine 3000的比较实验中，根据其操作手册，将孵育后分析时间延长至96小时。细胞计数使用Trypan Blue染色和Countess II细胞计数器进行。使用TriZol法和High-Capacity cDNA反转录试剂盒提取并反转录RNA，随后利用SYBR Green染料进行定量PCR（qPCR），检测特定基因（如VRC01抗体轻链区域）的表达水平。
结果
加载条件优化
研究开发了一种具有双表面活性剂表面化学性质的碳纳米管配方。首先使用DSPE-PEG-胺分散MWCNT，以获得离散且低细胞毒性的纳米管。然后添加高正电荷密度的分支型聚乙烯亚胺（bPEI），以促进DNA-纳米管复合物的形成、细胞内存和内涵体逃逸。通过显微镜观察确定最优的表面活性剂质量比配方，确保分散液中无聚集。
通过琼脂糖凝胶电泳评估了聚乙烯亚胺分子量（10 kDa， 25 kDa， 270 kDa）以及do-MWCNT与质粒DNA的质量比对DNA结合的影响。结果显示，在模拟的脱载环境中，270 kDa的bPEI与20:1的do-MWCNT:pDNA质量比能最有效地抑制DNA迁移，表明其形成了最稳定的复合物。这被确定为最佳的负载条件。
pDNA加载条件优化
为了验证20:1的负载比，测试了10:1、20:1和25:1三个比例。qPCR结果显示，20:1的质量负载组在转染相关基因表达上显著优于其他两组，因此后续优化实验均采用此比例。
DNA加载温度的影响
研究了4°C、27°C和37°C三种温度对复合物形成的影响。结果显示，4°C下孵育7小时能产生最高的基因表达，而37°C下表达显著降低。因此，后续实验选择在4°C下进行孵育。
DNA加载时间的影响
测试了do-MWCNT与pDNA孵育1小时、3小时、7小时、24小时、32小时、48小时、96小时和168小时对转染效率的影响。研究发现，随着孵育时间的延长，质粒的基因表达量也随之增加，在96小时达到峰值，且相对于48小时和168小时有显著提升。同时，细胞计数数据表明，在96小时孵育条件下，转染效率的提高并未伴随细胞数量的显著下降（与48小时相比无显著差异），表明此时细胞毒性较低。尽管在168小时观察到细胞健康度显著下降，但这可能与长时间孵育导致复合物聚集有关。因此，96小时被认为是平衡转染效率与细胞毒性的最佳孵育时间。
do-MWCNT与Lipofectamine 3000的比较
在优化条件下（96小时孵育，20:1质量比，4°C），将do-MWCNT与商业转染试剂Lipofectamine 3000进行了对比。细胞毒性方面，与未处理组相比，使用Lipofectamine 3000（全剂量）处理的CHO-K1细胞数量显著下降了约30%，而do-MWCNT处理组和Lipofectamine半剂量组则未显示出显著的细胞毒性。
qPCR结果表明，在相同条件下，do-MWCNT产生的质粒基因表达平均比Lipofectamine 3000（全剂量）高出约11%。这表明do-MWCNT在实现更高转染率的同时，对细胞数量的影响更小。然而，当剂量减半时，Lipofectamine的转染效率超过了do-MWCNT。
从do-MWCNT到单壁碳纳米管（SWCNT）的转化
为了探究不同纳米管几何形状对转染的影响，研究使用相同的表面活性剂配方方法制备了氧化的单壁碳纳米管（SWCNT）分散液，并按粒子匹配比例调整了表面活性剂浓度。基于表面面积计算，SWCNT:pDNA的质量比约为2.1:1。
转染实验显示，SWCNT同样能够实现基因转染。由于SWCNT所需的质量远低于do-MWCNT（约为15分之一），研究进一步测试了1倍、2倍和4倍初始剂量的效果。细胞毒性数据显示，增加SWCNT的剂量并未显示出显著毒性，而do-MWCNT在2倍剂量下细胞数量已出现显著下降。
有趣的是，随着SWCNT剂量的增加，转染效率反而下降。这可能与碳纳米管数量增加导致的潜在聚集有关。研究指出，do-MWCNT和SWCNT分散液在最大剂量时，每毫升所含的碳纳米管个体数量大致相同（约9.04 × 1010个）。这表明碳纳米管转染系统的上限可能与单个碳纳米管的数量而非总质量更相关。
讨论
研究指出，碳纳米管作为转染剂的应用潜力首次在2005年被报道。然而，本研究发现，与文献中通常报道的较短的复合时间（如30分钟）相比，do-MWCNT与pDNA需要长达96小时的孵育时间和相对较高的负载比（20:1），这可能意味着二者之间是一个缓慢的物理相互作用过程，而非pDNA与纳米管结合过紧的问题。
一个重要的应用前景在于，碳纳米管可能克服其他转染剂（如LNP）在大质粒（如用于CRISPR基因编辑的大于5 kb的质粒）递送上的效率限制。本研究所用的质粒编码VRC01人源抗HIV抗体，do-MWCNT更高的表达水平对于未来基于哺乳动物系统的抗体治疗或生物制造具有潜在价值。
值得注意的是，尽管do-MWCNT能导致高水平的转染相关基因表达，但在使用eGFP（增强绿色荧光蛋白）报告质粒时，观察到的荧光信号却很微弱。这被认为与细胞内部或周围积累的碳纳米管对荧光的淬灭效应有关。
相比之下，SWCNT则没有表现出明显的荧光淬灭问题。
作为一种转染试剂，do-MWCNT的一个优势是材料成本低于Lipofectamine 3000。成本分析显示，在达到相同转染水平（单位RQ值）时，do-MWCNT的材料成本大约是Lipofectamine 3000的1/36，而SWCNT的成本优势约为Lipofectamine的1/18.5。此外，do-MWCNT是单组分系统，可直接在含血清的培养基中使用，无需像Lipofectamine那样依赖Opti-MEM等特定培养基。
do-MWCNT的主要缺点在于复合物形成时间过长。长孵育时间可能阻碍其广泛采用，超声处理可能有助于pDNA形成更易于与纳米管相互作用的构象，是未来优化的一个方向。
SWCNT的应用意义
将优化配方从多壁碳纳米管（MWCNT）转化到单壁碳纳米管（SWCNT）的研究表明，即使在碳纳米管质量大幅降低（约15倍）的情况下，SWCNT仍能达到约do-MWCNT一半的转染能力。这意味着SWCNT在单位碳质量和单位表面活性剂用量上具有更高的转染效率。此外，SWCNT具有更多生物学优势：单壁结构更容易被细胞内的氧化酶系统降解，减少了长期潜在的毒性顾虑；对荧光的吸收/淬灭效应较低，有利于基于荧光的检测应用（如流式细胞术）。
总之，这项研究展示了碳纳米管作为一种有竞争力的转染剂的潜力。其转染效能与当前商业解决方案相当，在某些方面（如细胞毒性、大质粒递送潜力、成本）具有优势。尽管存在复合时间长的挑战，但它为当前转染方法无法达到理想效果的情况提供了另一种有前景的选择。
