《Animal Diseases》：Fatal parvoviral infection in captive cougars (Puma concolor): lessons for improving preventive health in wildlife exhibits
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本篇研究报道了中国南京红山森林动物园内一例圈养美洲狮（Puma concolor）感染猫泛白细胞减少症病毒（FPV）致死的病例。尽管该个体曾接种三联疫苗，但病毒学与病理学分析证实其感染了与本地家猫流行株遗传高度相似的野毒株，揭示出疫苗保护可能存在的缺口及病毒从家养动物向圈养野生动物“溢出”的风险。研究强调了在“同一健康”（One Health）框架下，加强分子监测、评估疫苗效力及完善动物园生物安全措施的重要性。
引言
猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus, FPV）是猫科动物（Felidae）中一种高度传染性、常致死的细小病毒病原体。该病毒会引起急性胃肠炎、严重白细胞减少和脱水，易感宿主死亡率高。FPV具有极强的环境抵抗力，可在受污染的围栏、设备或土壤中保持传染性达数月之久。尽管已有有效疫苗，但由于免疫覆盖率、抗原变异和生物安全执行方面的挑战，FPV仍在全球范围内导致疫情爆发。
在家猫中，FPV感染已有详尽的临床和病理学特征描述。然而，对于非家养猫科动物，特别是圈养种群，FPV带来了独特挑战。许多动物园中的猫科动物，如豹、虎、猞猁和美洲狮，对自然流行病毒的接触有限，导致免疫易感性。此外，针对珍稀物种的疫苗接种方案通常基于家猫数据外推而来，可能因种间免疫差异或抗原不匹配而无法提供充分保护。来自非洲、欧洲和亚洲的报告已记录了动物园饲养的豹、猎豹和兔狲的FPV感染病例，说明了该病毒跨物种传播的能力及其对受威胁食肉动物的保护意义。
在中国，FPV在家猫和流浪猫种群中仍呈地方性流行。近期的分子流行病学研究揭示了流行毒株间广泛的遗传多样性，包括病毒蛋白2（VP2）基因的氨基酸替换，这可能改变宿主范围和疫苗识别。2024年，有研究报道了西宁野生动物公园圈养兔狲（Otocolobus manul）中首次FPV爆发，尽管进行了兽医干预，仍有四只幼崽死亡。这些发现表明病毒持续进化并维持着毒力，提示从家养动物库向圈养野生动物“溢出”的风险持续存在。
病例呈现
患病史
2022年6月，南京红山森林动物园一只一岁大的圈养雌性美洲狮在无明显前驱症状的急性病程后被发现死亡。该动物在到达动物园时曾接种过包含猫泛白细胞减少症病毒、猫疱疹病毒和猫杯状病毒抗原的三联猫用疫苗。死亡后，立即启动了尸检采样和设施级控制措施。同舍饲养的雄性美洲狮被转移到隔离区域进行密切观察。同时，附近的食肉动物展区（“猫科星球”和“中国猫科馆”）也迅速进行了健康检查和环境筛查。
临床发现
死亡前未观察到异常行为或临床症状。发现时，尸体营养状况良好，腹部轻度膨大，肛周及尾部有粪便痕迹。口鼻周围可见绿色液体。
标本制备
死后立即采集直肠拭子和粪便样本，使用商用侧向流动抗原（Lateral-flow antigen, LFA）检测法进行FPV检测。FPV检测线呈强阳性，而犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）检测线呈弱阳性。在尸检过程中，无菌采集了包括十二指肠、空肠、回肠、胃、肠系膜淋巴结、脾、肝、肺、肾、心和胸腺在内的代表性组织样本。部分样本固定于10%中性福尔马林缓冲液（10% neutral buffered formalin, NBF）中用于组织病理学和免疫组织化学检查；另一部分样本则冻存于-80°C用于核酸提取和病毒分离。
病理学发现
大体病理
尸检显示的特征性病变与FPV相关病毒性肠炎一致。整个尸体呈现急性全身衰竭迹象。可见肛周粪便污染和轻度口腔分泌物。肺脏呈暗红色，明显充血，伴有外周性肺气肿。胃肠道显示节段性黏膜脱落和多灶性点状出血，胃和肠内容物混有黏液和血凝块。肝脏呈现弥漫性颜色变深，脾脏轻度肿胀。肠系膜淋巴结略肿大，而心脏和大脑等其他器官未见明显大体异常。这些发现提示存在急性循环障碍和由FPV引起的严重细小病毒性肠炎。
组织病理学
显微镜检查显示与猫泛白细胞减少症病毒感染一致的病变，主要影响肠道。心肌细胞结构完整，未见明显病变。肝脏显示轻度肝细胞核固缩，无其他显著异常。脾脏可见小梁增生、脾小体内淋巴坏死、生发中心缩小以及整体脾萎缩。肺部显示部分肺泡间隔轻度增厚和局部代偿性扩张。肾间质轻度充血伴局灶性出血。食道上皮坏死并脱落。胃黏膜上皮细胞轻度坏死，表面覆盖黏液并散在有炎性细胞。在十二指肠、空肠和回肠中，可见肠上皮坏死和脱落，黏膜表面附着黏液和少量纤维素。隐窝上皮细胞坏死，形成空泡化空间，黏膜下层有大量炎性细胞浸润。最显著的病变出现在肠道，其特征是黏膜坏死和脱落，特别是涉及隐窝上皮细胞坏死。
分子检测与免疫组织化学
使用通用引物和FPV-VP2特异性引物进行聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）扩增。琼脂糖凝胶电泳显示大小分别约为400 bp和750 bp的清晰单一条带，符合细小病毒和FPV特异性扩增产物的预期大小。从肠组织和粪便中提取的DNA经通用引物和FPV特异性引物检测均呈细小病毒阳性。
对于免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC），使用小鼠抗FPV单克隆抗体作为一抗，兔/鼠通用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin–horseradish peroxidase, HRP）偶联物作为二抗。在空肠和十二指肠的肠隐窝上皮细胞中观察到特异性的棕色DAB信号，表明FPV抗原定位于受累组织。
病毒分离与遗传特征
将过滤后的PCR阳性肠组织和粪便样本接种到Crandell–Rees猫肾（Crandell–Rees feline kidney, CRFK）细胞上进行病毒分离。经过三次盲传后，与对照细胞相比未观察到明显的细胞病变效应（Cytopathic effect, CPE），但注意到轻微的细胞生长迟缓。使用小鼠来源的抗FPV单克隆抗体作为一抗，DyLight 488标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay, IFA）验证了病毒复制。在感染的CRFK细胞中观察到明显的绿色荧光，而阴性对照中未检测到信号。
从细胞培养上清液中提取的DNA，使用FPV VP2全长引物进行扩增，得到了大小约为1700 bp的特异性条带，与预期片段大小一致。
对VP2基因全长（1753 bp）进行测序，结果显示该分离株与来自江苏省及邻近上海地区的家猫FPV野毒株具有近乎完全相同的核苷酸同源性。与疫苗株Felocell相比，在80、93、103、323、564和568位的关键氨基酸残基是保守的，但在A91S、I232V和L562V位点发生了替换。位于91和232位点的变化位于已知的抗原环中，可能影响病毒抗原性。系统发育分析进一步显示，该分离株与来自中国北方、西南部和东部的FPV参考株紧密聚集，形成了一个与FPV和CPV疫苗株分开的独立分支。
在14天的观察期内及之后，未发现其他FPV病例，也未再有复发报告，表明疫情已得到成功控制。
讨论
流行病学意义
分子分析表明，美洲狮分离株的VP2基因与江苏和上海家猫中流行的FPV毒株密切相关。这一发现强烈提示发生了本地病毒“溢出”事件，很可能来自动物园内或周围存在的流浪猫或野猫。工作人员调查进一步指出，在美洲狮死亡前不久曾观察到流浪猫出现在围栏附近，这为潜在的环境暴露提供了额外的流行病学证据。这种跨物种传播与先前的研究一致，表明在家养种群中流行的FPV变种能够在圈养条件下感染野生猫科动物。与家养毒株的遗传相似性强调了城市适应性流浪猫种群作为连接人类定居点与野生动物圈养环境之间桥梁的病毒库作用。
疫苗接种与抗原变异
这只美洲狮在购入时曾接种过包含FPV、猫疱疹病毒和猫杯状病毒抗原的三联猫用疫苗。在已免疫的情况下仍发生致命性FPV感染，这引发了重要关切。可能的解释包括免疫力减弱、单次疫苗接种后血清转化不完全，或疫苗株与野毒株之间的抗原不匹配。测序揭示了与Felocell疫苗株相比的三个氨基酸替换：A91S、I232V和L562V。其中两个变化，A91S和I232V，发生在VP2的已知抗原环内，可能影响病毒中和作用。类似的替换在既往研究中与宿主范围改变或疫苗效力降低有关。这些观察结果支持了定期评估疫苗对当代流行株效力的必要性，以及可能需要对适用于珍稀猫科动物和动物园环境的疫苗配方进行更新。
控制与生物安全
美洲狮死亡后的迅速反应防止了病毒在设施内的进一步传播。采取的措施包括转移并监测同舍雄性美洲狮、交替使用病毒消杀剂进行消毒、限制工作人员在围栏间的流动，以及积极将野猫驱离动物园场地。附近所有猫科动物FPV检测均为阴性，且至今未发现后续病例，这证明了早期控制和严格生物安全的有效性。类似的策略已被证明对于限制家养和野生动物设施中的细小病毒爆发至关重要，因为病毒在环境中的持久性可能导致反复感染。
“同一健康”与生态系统视角
从“同一健康”（One Health）的角度来看，此病例凸显了家养动物、野生动物和环境健康之间的相互联系。FPV在环境中的持久性及其跨越物种边界的能力，例证了生态系统层面的动态如何影响圈养野生动物中的疾病出现。动物园内外流浪猫的存在代表了持续的病毒输入风险，它们作为病毒库促进了种间传播。稳定的细小病毒颗粒造成的环境污染进一步将这种风险延伸至直接接触之外，阐明了生态因素和管理因素如何共同作用以塑造疾病生态学。
因此，在动物园环境中有效预防FPV需要一种综合方法，涵盖环境卫生、流浪动物种群管理、常规分子监测和适应性疫苗接种策略。定期筛查家养和野生食肉动物，结合环境病毒监测，可以为潜在的“溢出”事件提供早期预警。在“同一健康”框架下，兽医、野生动物管理者和公共卫生当局之间的合作，对于保护生物多样性、减少传染病在人类-动物-生态系统界面的共患和生态影响至关重要。
结论
本报告记录了中国首例经确诊的圈养美洲狮致命性FPV感染病例。遗传学和流行病学证据表明，这很可能是一次来自家猫种群的病毒“溢出”事件，强调了FPV在家养-野生动物界面传播的持续威胁。尽管事先进行了疫苗接种，但仍发生了致命疾病，这凸显了持续评估疫苗效力以及为非家养猫科动物制定针对性免疫策略的必要性。本次事件的成功控制，证明了快速诊断确认和协调的生物安全应对措施的价值。总之，该病例强化了在管理动物园机构和更广泛生态系统中的传染病风险时，采用“同一健康”视角的重要性。
