慢性应激在急性外阴炎症后增加外阴痛易感性：一项临床前模型的揭示

《Molecular Brain》：Chronic stress increases the susceptibility to chronic vulvar pain following acute vulvar inflammation in a preclinical model of vulvodynia

本研究通过雌性大鼠模型，首次揭示了慢性不可预测应激(CUS)作为一种心理社会因素，能显著增强急性外阴炎症后发展为慢性外阴疼痛的易感性，并伴随持续的焦虑和抑郁样行为。研究结合行为学、分子生物学及内分泌学方法，证明了应激、炎症与疼痛慢性化之间的关键相互作用，为外阴痛(PV)的生物-心理-社会模型提供了直接的实验证据，强调了在临床中关注患者心理状态与炎症管理并重的重要性。

　　

慢性应激在急性外阴炎症后增加外阴痛易感性：一项临床前模型的揭示

引言

慢性外阴疼痛可由神经损伤、创伤和炎症引起，导致外周伤害感受器敏化。然而，部分外阴疼痛疾病，如诱发性外阴痛(PV)，被认为是特发性疼痛障碍，没有明确的可识别原因。PV影响7%-15%的女性，其特征是在尝试阴道插入（如性交、使用卫生棉条）时出现外阴前庭的痛觉过敏、异常性疼痛和剧烈疼痛。PV的发病机制尚不清楚，病因是多因素的，涉及遗传、激素和免疫因素。

心理痛苦和慢性应激被认为是PV发展的一个因素。先前的研究表明，创伤事件、虐待、创伤后应激障碍可能促进外阴痛和外阴疼痛的发生。此外，越来越多的证据表明，与内源性镇痛功能障碍相关的中央机制是特发性疼痛疾病（包括PV）的神经机制基础。内源性疼痛调节/控制涉及直接或间接投射到脊髓背角的下行通路。最近的研究表明，应激会破坏几个参与下行疼痛调节和情绪调节的脑网络的正常活动，包括脑干核团（蓝斑、头端延髓腹内侧区、中缝背核）的单胺能神经元、中脑导水管周围灰质(PAG)和杏仁核。

有趣的是，越来越多的证据表明，与内源性镇痛功能障碍相关的中央机制是特发性疼痛疾病（包括PV）的神经机制基础。内源性疼痛调节/控制涉及直接或间接投射到脊髓背角的下行通路。最近的研究表明，应激会破坏几个参与下行疼痛调节和情绪调节的脑网络的正常活动，包括脑干核团（蓝斑、头端延髓腹内侧区、中缝背核）的单胺能神经元、中脑导水管周围灰质(PAG)和杏仁核。PAG作为下行疼痛调节和缓解的主要控制中心，其平衡活动对于情绪和疼痛调节至关重要。因此，在情绪障碍和慢性疼痛状况中已报告PAG活动功能障碍。此外，杏仁核被认为是疼痛和情绪回路的关键组成部分。先前的研究表明，杏仁核活动功能障碍导致下行疼痛通路失衡。然而，由于慢性应激导致的疼痛和情绪回路（例如PAG、杏仁核）的改变是否促进急性外阴炎症后急性疼痛向慢性外阴疼痛的转变，目前仍不清楚。因此，本研究旨在在大鼠成熟的外阴模型中，考察慢性应激对外阴炎症后焦虑、抑郁样行为以及慢性外阴疼痛发展的短期和长期影响。

结果

CUS诱导雌性大鼠外周痛觉过敏

评估了慢性不可预测应激(CUS)诱导前后外阴和后爪的外周痛觉过敏。分析显示，CUS会导致外周痛觉过敏的发展。因此，与非CUS组相比，CUS组的外阴机械阈值显著降低，后爪机械阈值也显著降低。这表明CUS可导致外周机械痛觉过敏增加。

CUS后焦虑和抑郁样行为水平增加

为了确认CUS方案能诱导焦虑和抑郁样行为，在两周CUS后进行行为测试。分析显示，CUS组表现出更高水平的焦虑。因此，与非CUS组相比，CUS组在高架十字迷宫(EPM)中避免进入开臂，在开臂停留时间更少，在闭臂停留时间更多。值得注意的是，EPM的焦虑指数分析显示，与非CUS组相比，CUS组的焦虑指数显著增加。在旷场实验(OF)中，与非CUS组相比，CUS组的移动距离更大。此外，CUS组倾向于在场地中心停留时间更少，在周边停留时间更多。

此外，在CUS后观察到抑郁样行为和快感缺乏症状。因此，与非CUS组相比，CUS组的蔗糖摄入百分比降低。此外，我们进行了情绪性Z分数分析，以研究整合不同焦虑样行为测试结果的潜力。分析显示，与非CUS组相比，CUS组的情绪性显著降低。

CUS后的皮质酮水平和基因表达变化

在两周CUS后，我们评估了血液中的应激标志物皮质酮水平。分析显示，与非CUS组相比，CUS组的皮质酮水平显著增加。此外，我们检测了与神经元激活和Gaba合成相关的基因在参与应激、情绪和疼痛调节的杏仁核(Amg)和中脑导水管周围灰质(PAG)中的表达。我们发现，与基线和非CUS组相比，CUS导致杏仁核中神经元激活标志物c-Fos以及Gaba合成(GAD67)的转录显著增加，PAG中的转录在CUS后也显著增加。

CUS增加急性外阴炎症后慢性外阴疼痛发展的易感性

在CUS程序之后，大鼠被随机分配到外阴注射组之一：非CUS/生理盐水、非CUS/酵母聚糖、CUS/生理盐水、CUS/酵母聚糖。在第20天（即最后一次CUS刺激后5天）于外阴注射生理盐水或酵母聚糖。生理盐水或酵母聚糖注射后五天，所有组的外阴机械阈值均显示显著降低。然而，外阴机械阈值在外阴注射（生理盐水或酵母聚糖）和应激经历（非CUS或CUS）后显示出不同的恢复模式。因此，在单次酵母聚糖诱导的外阴炎症刺激后，先前暴露于CUS的大鼠（CUS/酵母聚糖）的外阴机械敏感性阈值保持了40天的降低，而之前没有慢性应激暴露的大鼠（非CUS/酵母聚糖）的外阴机械敏感性阈值在外阴炎症刺激后20天内恢复到基线水平。值得注意的是，在外阴注射生理盐水后，先前暴露于CUS的大鼠（CUS/生理盐水）的外阴机械敏感性阈值保持了20天的降低，而之前没有慢性应激暴露的大鼠（非CUS/生理盐水）的外阴机械敏感性阈值在外阴炎症刺激后5天内恢复到基线水平。总体而言，非CUS/生理盐水、非CUS/酵母聚糖、CUS/生理盐水组的外阴机械敏感性阈值恢复到基线，但CUS/酵母聚糖组没有恢复。

CUS合并慢性外阴疼痛导致长期的焦虑和抑郁样行为

在第61天至第68天（即外阴注射生理盐水/酵母聚糖后41-48天），我们进行了EPM、OF和SPT测试。我们发现应激经历对开臂进入比例有显著的主效应，并且应激经历和外阴注射之间存在交互作用。因此，与非CUS组相比，CUS组避免进入开臂。交互作用源于CUS/生理盐水组与非CUS/生理盐水组相比开臂进入比例降低。此外，应激经历对闭臂停留时间有显著的主效应。因此，CUS/酵母聚糖组与非CUS/生理盐水组相比，在闭臂停留时间更长。关于EPM和OF测试中的移动距离，分析显示应激经历和外阴注射存在显著的交互作用。交互作用源于CUS/生理盐水组在EPM中的移动距离较非CUS/生理盐水组增加。值得注意的是，Tukey分析显示OF中的移动距离没有显著差异。在OF中，应激经历和外阴注射对在场地中心停留的时间存在显著的交互作用。因此，非CUS/生理盐水和CUS/酵母聚糖在中心停留的时间比CUS/生理盐水和非CUS/酵母聚糖更长。此外，在CUS组中观察到抑郁样行为和快感缺乏症状。因此，应激经历对蔗糖摄入有显著效应。因此，CUS/生理盐水和CUS/酵母聚糖组与非CUS/生理盐水和非CUS/酵母聚糖组相比，蔗糖摄入量减少。

讨论

目前的结果表明，动物的CUS会诱导外周痛觉过敏，并增加焦虑和抑郁样行为，同时伴随与疼痛和情绪调节相关的脑区的基因表达变化以及皮质酮水平升高。更重要的是，CUS被发现在急性外阴炎症刺激后增加了对慢性外阴疼痛和情绪障碍的易感性。据我们所知，这是第一项强调心理应激和急性炎症在驱动外阴疼痛发展中具有协同作用的研究。此外，当前的模型密切反映了临床状况，并证实了先前的研究结果，即有心理应激史的女性在经历急性外阴炎症刺激后（通常只会引起短暂而非慢性的疼痛）发生外阴痛的风险增加。

临床和临床前证据表明，外阴疼痛的严重程度与情绪障碍有关，包括压力水平升高、焦虑和抑郁症状，这表明慢性外阴疼痛可能导致情感障碍的出现。然而，应激本身是否在慢性外阴疼痛的发展中起因果作用仍不清楚。在本研究中，我们提供了令人信服的证据，表明慢性应激诱导了一种潜在的敏化和启动效应，其中动物对急性外阴炎症表现出加剧和延长的反应。

慢性外阴疼痛的发展不仅仅归因于炎症机制。反复的外阴炎症已被证明会引起持续性外阴疼痛，而不像急性炎症通常只会导致暂时的异常性疼痛。然而，目前的研究结果表明了一种新机制，即慢性应激使伤害感受系统敏化，在最初的炎症事件后促进从急性疼痛向慢性外阴疼痛的转变。这些结果支持了一个多因素的病理生理学模型，表明外周炎症过程和中枢应激介导的敏化之间的相互作用有助于慢性外阴疼痛（诱发性外阴痛）的发生和维持。

流行的假设认为，应激通过破坏情绪和疼痛调节系统的正常活动导致潜在敏化，包括脑干核团（LC、RVM）的单胺能神经元、PAG和杏仁核。这可能解释了特发性疼痛障碍患者情绪障碍和疼痛症状之间的双向关联。因此，血清素和去甲肾上腺素系统成为慢性疼痛治疗的目标。具体来说，是血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRIs)药物。值得注意的是，我们先前已在慢性外阴疼痛的临床前模型中证实了SNRI治疗药物文拉法辛的镇痛和抗焦虑作用。

杏仁核被认为是疼痛和情绪回路的关键组成部分。几项研究表明，人类和实验动物的慢性疼痛障碍中存在杏仁核活动异常。由于慢性疼痛中杏仁核功能障碍，焦虑样行为和抑郁是非常预期的。事实上，高达50%的慢性疼痛患者表现出焦虑和抑郁症状。值得注意的是，抑郁和焦虑的存在已被发现会导致疼痛持续时间延长和强度增加，从而助长疼痛和情绪障碍症状的自我延续循环。这些发现支持了心理痛苦和慢性应激（可能导致杏仁核功能障碍）也有助于特发性疼痛的病理生理学的观点，当没有明确的可识别原因时。值得注意的是，先前的研究表明，杏仁核活动功能障碍导致下行疼痛通路失衡。因此，杏仁核通过中央杏仁核直接控制PAG中大量的投射。有趣的是，先前的证据表明，在实验室动物中，中央杏仁核输出增加会在没有任何组织病理学的正常条件下产生疼痛反应，更重要的是，在慢性应激的动物模型中。我们的结果可能支持这些观察结果；因此我们观察到在CUS后杏仁核中神经元激活标志物（cFOS）和GABA合成增加。

PAG作为下行疼痛调节和缓解的主要控制中心，其平衡活动对于情绪和疼痛调节至关重要。因此，在情绪障碍和慢性疼痛状况中已报告PAG活动功能障碍。此外，我们的结果表明CUS导致PAG中激活和GABA合成的变化，表明PAG信号失衡。有趣的是，先前的研究结果表明，由于慢性应激或实验室药理干预导致的PAG兴奋性和抑制性信号失衡会引发抑郁样行为和机械性异常性疼痛。可能，过度激活的PAG-GABA能神经元（投射到RVM/LC）可能会损害下行疼痛通路（即减少脊髓中5HT和NE的释放），导致上行通路中的疼痛信号放大。然而，慢性应激是否诱导下行疼痛调节通路功能障碍从而促进慢性外阴疼痛的发展，仍未完全清楚。在当前研究中，我们提供了支持这一假设的行为学证据。然而，必须对启动过程中所涉及的特定神经元回路和通路进行全面研究，以阐明其潜在机制。我们明确承认这是本研究的一个局限性，并强调需要未来的研究来解决这个问题。

考虑到情绪障碍在慢性外阴疼痛个体中经常被报告，本研究得出的见解为了解PV的病因学以及应激在促进其发展中的作用提供了宝贵的贡献。因此，当前的研究结果可能具有几个重要的临床意义，包括早期识别和管理有PV风险女性的心理应激的重要性。这种方法可能有助于降低她们在由念珠菌或感染引起的急性外阴炎症后发生PV的可能性。此外，解决炎症和心理社会维度的多学科方法，包括压力管理、认知行为疗法和药物干预，可能会改善患有或有PV风险女性的临床结果。值得注意的是，目前的研究结果也支持在未来临床试验中将应激相关生物标志物（例如皮质醇水平）和心理评估作为治疗反应和PV易感性的潜在预测指标。因此，我们发现慢性应激会引起应激标志物的显著增加，这可能促进慢性外阴疼痛的发展。总的来说，本研究强调了理解PV的生物心理社会框架，并强调了针对导致慢性外阴疼痛的外周和中枢机制的综合临床策略的重要性。

本研究的优势包括在多个时间点全面评估疼痛敏感性和心理行为，无论之前是否有慢性应激暴露。此外，本研究中采用的外阴疼痛模型在急性炎症刺激后有效地诱导了持久的机械痛觉过敏。值得注意的是，行为变化的持续性可能突出了当前模型的转化相关性和实用性，该模型整合了心理应激和急性炎症在慢性外阴疼痛的发展和维持中的联合效应。

我们的研究有几个局限性需要承认。首先，每个组的样本量适中，这可能会影响研究结果的解释。因此，使用更大样本的重复实验对于确立当前发现的效度和推断其实际意义至关重要。在这里，我们关注了应激后杏仁核、PAG中的基因表达变化。然而，这些脑区很可能只是疼痛和情绪调节系统的一部分。因此，其他脑区，如岛叶和前扣带回皮层(ACC)，可能在这一过程中更为关键。在当前研究中，我们提供了行为学证据，表明慢性应激促进了慢性外阴疼痛的发展。然而，这种效应的具体神经元机制仍不清楚。这代表了本研究的一个局限性，我们强调需要未来的研究来阐明潜在的神经通路和机制。尽管存在这些局限性，我们的研究结果表明，慢性应激增强了急性炎症后慢性外阴疼痛的易感性，同时伴有持续的焦虑和抑郁样行为以及与疼痛和情绪调节相关的脑区的基因表达变化。这些发现支持了PV的生物-心理-社会模型，强调了应激和炎症在疼痛慢性化中的相互作用。