《Arthritis Research & Therapy》：Sj?gren’s patient subgroups identified through whole genome DNA methylation profiling
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本研究通过分析唇唾液腺的全基因组DNA甲基化数据，首次在大样本队列中揭示了干燥综合征（SjD）患者存在具有显著不同临床特征与细胞组成的表观遗传亚群。研究不仅验证了DNA甲基化作为区分患者亚型的有效工具，还通过细胞特异性分析，深入阐述了B细胞和上皮细胞中的关键差异甲基化基因（如NR2F2、NDRG2）及其在疾病发病机制（如干扰素通路、雌激素信号）中的潜在作用，为理解SjD的异质性和开发精准诊疗策略提供了新的生物学见解。
引言
干燥综合征（Sj?gren‘s disease, SjD）是一种以淋巴细胞浸润外分泌腺导致严重口眼干燥为特征的多系统自身免疫性疾病，在美国是仅次于类风湿关节炎的第二常见系统性自身免疫病，女性与男性的发病率比约为14:1。尽管美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）已认可了SjD的确定性分类标准，但目前尚未制定疾病亚群特异性的分类标准。该病临床表现异质性高，且其潜在的生物学机制尚不完全清楚。
既往研究已利用多种数据来源尝试对SjD患者进行亚群分类，例如基于自身抗体状态或症状聚类。近年来，表观遗传学，特别是DNA甲基化（DNA methylation, DNAm），在理解SjD发病机制中的作用日益受到关注。有研究表明，DNA甲基化可以基于临床特征区分SjD病例亚组，但这些研究样本量较小，且未考虑唇唾液腺（labial salivary glands, LSGs）样本中固有的细胞异质性。因此，本研究旨在：（1）利用LSGs的DNAm数据识别患者亚群；（2）研究各亚群的临床特征；（3）识别SjD病例亚组间的差异甲基化，以进一步理解相关的生物学通路。
材料与方法
本研究人群来自国际干燥综合征协作联盟（Sj?gren’s International Collaborative Clinical Alliance, SICCA）注册库，共包括1059名参与者，其中SjD病例592名，有症状的非病例467名。所有参与者均为女性，且无非西班牙裔白人或东亚裔以外的其他自身免疫性、系统性或结缔组织疾病。SjD病例状态根据2016年ACR/EULAR分类标准确定。
研究使用Illumina HumanMethylationEPIC BeadChip芯片对LSGs样本进行全基因组DNA甲基化分析。数据预处理使用了Minfi等生物信息学工具，并利用HEpiDISH算法基于实体组织参考集估计了样本中的细胞类型比例，包括上皮细胞、成纤维细胞以及B细胞、单核细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等七种免疫细胞亚型。
为了从高维甲基化数据中提取有效特征，研究采用了变分自编码器（variational autoencoder, VAE）来学习数据的低维潜在表示。随后，使用ConsensusClusterPlus包对VAE学习到的特征嵌入进行层次聚类，以获得稳定的患者分组。为了识别不同亚组间的差异甲基化，研究使用了Bumphunter进行差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs）分析，并使用CellDMC结合comb-p工具进行了细胞特异性的差异甲基化分析。最后，对识别出的差异甲基化基因进行了基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），以探索其涉及的生物学通路。
结果
SICCA参与者亚群的识别
通过对所有参与者VAE嵌入特征的层次聚类，初步识别出四个不同的聚类。其中，聚类2和4主要由SjD病例组成（92%为病例），而聚类1和3主要由非病例组成（65%为非病例）。进一步分析发现，位于聚类2和4的SjD病例（称为亚组2-4，N=358）相较于位于聚类1和3的SjD病例（称为亚组1-3，N=234），表现出更多反映更高自身免疫水平的表型特征和更高频率的SjD相关临床表现。例如，亚组2-4的病灶评分（focus score, FS）均值（3.7）显著高于亚组1-3（1.3，p<0.01），并且抗核抗体（ANA）、抗La/SSB抗体、类风湿因子阳性率以及补体C3、C4水平降低等指标也显著更高。因此，后续分析聚焦于比较这两个SjD病例亚组。
LSGs中的细胞类型估计
细胞类型比例估计结果显示，上皮细胞是LSGs中最主要的细胞类型，其次是成纤维细胞。两个SjD病例亚组间的细胞组成存在显著差异。总体而言，亚组1-3的上皮细胞比例高于免疫细胞，而亚组2-4的免疫细胞比例则有所增加。差异最明显的是上皮细胞和B细胞：在亚组1-3中，它们分别占细胞的55%和8%，而在亚组2-4中，则分别占35%和16%。
差异甲基化区分SjD病例亚群
在对LSGs进行整体分析时，在校正细胞类型比例前识别出815个显著DMRs，但校正后无一显著。这凸显了进行细胞特异性分析的必要性。细胞特异性分析显示，B细胞和上皮细胞中观察到的差异甲基化位点（differentially methylated positions, DMPs）和区域（DMRs）数量最多。
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在B细胞中，一些最重要的DMRs位于基因内部，包括NR2F2（甲基化降低56%）、PPP1R18（甲基化降低93%）、NDRG2（甲基化增加95%）和LAT（甲基化降低75%）。
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在上皮细胞中，排名靠前的DMRs位于IRF5（甲基化降低8%）、ARID3A（甲基化降低12%）和ZMYND8（甲基化增加2%）等基因中。
基因集富集分析
基因集富集分析显示，在上皮细胞中，低甲基化的DMRs富集于先前研究中发现的、在SjD病例与非病例间存在低甲基化的基因集中。上皮细胞的低甲基化DMPs则富集于B细胞受体信号通路等相关通路。在B细胞中，DMPs富集于神经元命运决定等通路，而DMRs则富集于蜕皮周期、皮肤表皮发育等通路。
讨论
本研究利用LSGs的DNA甲基化数据识别出了具有不同甲基化谱和临床特征的SjD患者亚群。亚组2-4表现出更高的自身免疫特征和更多的SjD相关临床表现，其免疫细胞（尤其是B细胞）比例也更高，而上皮细胞比例较低。这一发现与更高的病灶评分（反映LSGs中免疫细胞浸润程度）相一致。
细胞类型在SjD发病机制中扮演不同角色。本研究的主要发现集中在B细胞和上皮细胞，这两者在SjD病理中作用关键。B细胞驱动唾液流速降低、唾液腺淋巴细胞浸润增加、自身抗体形成和生发中心形成。B细胞DMPs在神经元命运决定通路中的富集，提示可能与唾液分泌的神经调节受损有关。上皮细胞则是炎症细胞因子的来源，并参与B细胞活化因子（B-cell activating factor, BAFF）的产生，从而刺激B细胞。上皮细胞中低甲基化DMPs在B细胞受体信号通路中的富集，可能表明亚组2-4的上皮细胞促进了观察到的B细胞比例增加。
对关键差异甲基化基因的讨论揭示了它们与SjD病理的潜在联系：
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B细胞中的NR2F2**：该基因在SjD小鼠模型的泪腺中已报道存在差异表达。
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B细胞中的NDRG2：该基因参与雌激素介导的离子和液体转运，在雌激素缺乏的大鼠模型中引入该基因可显著增加唾液分泌。SjD在女性中更常见，雌激素水平可能在疾病发生中起作用。本研究中观察到的NDRG2高甲基化可能意味着其在亚组2-4中的表达降低。
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B细胞中的LAT**：该基因参与T细胞抗原受体（T-cell antigen receptor, TCR）信号通路，其变异与家族性类风湿关节炎、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）和SjD相关。
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上皮细胞中的IRF5**：该基因编码干扰素调节通路中的蛋白，其多态性与SjD和SLE均有关联。干扰素失调是SjD的一个标志性特征。
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上皮细胞中的ARID3A**：在SLE患者的PBMC B细胞中，其表达显著增加并与更严重的病情相关。
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上皮细胞中的ZMYND8**：这是一个肿瘤抑制基因，与淋巴瘤发展有关。SjD患者患非霍奇金淋巴瘤的风险总体增加，其高甲基化可能意味着该肿瘤抑制基因表达降低。
研究的优势与局限性
本研究的优势包括使用了SjD主要靶组织LSGs进行甲基化分析、首次在大样本LSGs研究中校正了细胞类型差异、以及包含了有症状的非病例以增加聚类分析的样本量和信息量。
局限性主要在于缺乏LSGs特异的甲基化参考面板，现有的细胞类型估计算法可能无法完全准确地区分所有细胞类型（例如CD8+T细胞）。此外，效应大小计算中使用的线性回归模型可能导致大于100%的甲基化差异估计，这不符合生物学常理。本研究仅纳入女性参与者，且限于欧洲和东亚裔人群，结果可能无法推广到所有SjD患者。另外，SICCA队列数据收集时尚未广泛应用EULAR干燥综合征疾病活动指数（EULAR Sj?gren’s syndrome disease activity index, ESSDAI），因此无法用该指标进一步评估亚组间的表型异质性。
总结
总之，本研究通过分析LSGs的DNA甲基化数据，成功将SICCA注册库中的SjD病例和非病例聚类，识别出具有不同临床特征的SjD病例亚组。这两个观察到的SjD亚组表现出不同的细胞类型比例和预测细胞类型内的差异甲基化。这些发现强调了在SjD中进行细胞特异性分析的必要性。研究描述了许多在DNA甲基化上存在显著差异的基因和通路，这些发现有助于我们理解SjD的临床异质性，为建立预后和疾病进展的生物标志物以及未来开发治疗干预靶点提供了依据。
