《Molecular Medicine》：A novel CD112-derived peptide targeting gut-primed neutrophils to attenuate deadly hepatic injury
编辑推荐：
本研究发现，在肠缺血/再灌注损伤中，中性粒细胞通过与肠道上皮内淋巴细胞（IELs）相互作用而被激活，显著增强中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的释放能力。这些NETs阳性的活化中性粒细胞通过门静脉迁移至肝脏，加剧肝脏炎症与损伤。研究揭示该相互作用由中性粒细胞表面CD112与IELs上CD226介导，并开发了CD112衍生肽DPX2以靶向抑制该通路。动物实验表明，DPX2可有效抑制NETs形成、减轻肝组织炎症基因表达及肝细胞损伤，为干预肠-肝轴介导的继发性肝损伤提供了新靶点与潜在治疗策略。
引言：肠肝对话与炎症的细胞参与者
肠道与肝脏在解剖和功能上通过门静脉循环紧密相连，构成肠-肝轴。在全身性炎症中，源自肠道等肠外器官的炎症反应可诱发继发性肝功能不全，严重威胁患者预后。急性炎症的关键效应细胞——中性粒细胞，除了通过吞噬、脱颗粒和释放中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）造成组织损伤外，部分从原发组织逸出的活化中性粒细胞还可重新进入循环，将炎症扩散至肝脏等远端器官。NETs是由胞质和颗粒蛋白组成的巨大胞外网状结构，在宿主防御中发挥重要作用，但过度的NET形成与系统性炎症反应（如缺血/再灌注和脓毒症）中的组织损伤和器官衰竭有关。
肠道上皮内淋巴细胞（Intraepithelial Lymphocytes, IELs）是定植于肠上皮层内的特殊T细胞，构成机体最丰富的T细胞群体之一。IELs在维持黏膜免疫稳态和应对肠道感染中扮演关键角色。有研究发现，在脓毒症中，IELs可通过与中性粒细胞的相互作用，经由中性粒细胞CD112诱导NETosis（NET形成过程）。本研究假设，在肠缺血/再灌注（Gut I/R）损伤中，中性粒细胞在肠道黏膜与IELs相互作用，导致NETs形成，并通过门静脉循环将炎症播散至肝脏。进一步探索了CD112介导的中性粒细胞–IEL相互作用在此过程中的作用，并评估了通过新型CD112衍生肽DPX2阻断CD112–CD226信号的治疗潜力，旨在为减轻肠-肝炎症性损伤提供新见解。
材料与方法
本研究使用8-12周龄雄性C57BL/6小鼠，通过夹闭肠系膜上动脉60分钟后恢复灌注，建立肠I/R模型。假手术组进行相同操作但不夹闭血管。在再灌注开始时，模型小鼠被腹腔注射DPX2肽（1 μg/g体重）或对照载体PBS。4小时后收集血液、肠道和肝脏组织进行分析。通过流式细胞术和免疫荧光染色等方法分析了肠道上皮层中性粒细胞数量及其与IELs的共定位，并使用SYTOX Green染色和荧光显微镜评估了门静脉血和肝组织中NETs的形成。为明确IELs对中性粒细胞的激活作用，从肠I/R小鼠中分离IELs与中性粒细胞进行体外共培养，并构建了过继转移模型：将经IEL预刺激的“IEL-启动的中性粒细胞”或未经刺激的中性粒细胞通过流式细胞分选纯化后，注射至肠I/R小鼠体内，评估其对肝脏炎症的影响。基于计算机模型分析CD112与CD226的相互作用界面，设计并合成了源自CD112第249-261位氨基酸序列（RYPPEVSISGYDD）的肽段DPX2，通过表面等离子共振技术验证了其竞争性抑制CD112–CD226结合的能力，并在体内外评估了其药效。通过qPCR检测肝组织炎症因子基因表达，通过测定血浆天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平、进行肝脏苏木精-伊红（H&E）染色损伤评分以及TUNEL染色评估细胞凋亡来评估肝损伤程度。
结果
中性粒细胞受炎症性IELs刺激产生NETs并迁移至肝脏
研究发现，在肠I/R模型中，整个肠上皮层的中性粒细胞数量较假手术组显著增加。免疫染色显示，中性粒细胞与IELs在肠黏膜内共定位，提示两种细胞存在紧密相互作用。在体外，与从肠I/R小鼠分离的IELs共培养的中性粒细胞产生NETs的能力显著增强。更重要的是，与假手术组及全身循环血相比，肠I/R小鼠门静脉血中NETs阳性的中性粒细胞比例更高，且肝脏组织中NETs也增加，这表明激活的中性粒细胞从肠道迁移至了肝脏。
IEL启动的中性粒细胞加剧肝脏炎症
通过过继转移实验，研究发现接受IEL启动的中性粒细胞（即与IELs共培养过的中性粒细胞）的肠I/R小鼠，其肝脏炎症反应显著加剧。具体表现为，与接受未刺激中性粒细胞的小鼠相比，肝脏中M1巨噬细胞极化标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）以及趋化因子角质形成细胞衍生趋化因子（KC）和C-X-C基序趋化因子配体2（CXCL2）的mRNA表达水平均显著升高。这些结果表明，IELs启动的中性粒细胞能够恶化肠损伤后的肝脏炎症。
新型CD112衍生肽DPX2的发现及其对IEL诱导NETs的抑制作用
研究将治疗靶点聚焦于介导中性粒细胞–IEL相互作用的分子CD112。流式分析证实，肠I/R后肠道上皮中表达CD112的中性粒细胞数量显著增加。通过计算机建模分析CD112与CD226的相互作用界面，研究者设计并合成了一种新型CD112衍生肽，命名为DPX2。模型预测及表面等离子共振分析证实，DPX2能够与CD226强效结合，从而竞争性抑制CD112–CD226的相互作用。体外实验显示，在脂多糖（LPS）或缺氧/复氧等炎症条件下，DPX2处理能显著抑制IELs诱导的中性粒细胞NETs形成，效果优于对照组（PBS或乱序肽）。
DPX2减轻肠道来源的NETs及肝脏炎症
体内实验进一步验证了DPX2的疗效。在肠I/R模型中，再灌注开始时给予DPX2能显著减少门静脉血中检测到的NETs，表明其抑制了肠道来源中性粒细胞的激活。同时，与肠I/R对照组相比，DPX2治疗显著降低了肝脏中iNOS、IL-6、IL-1β、KC和CXCL2等炎症相关基因的表达水平。这些数据表明，DPX2能有效减轻由肠道来源中性粒细胞介导的肝脏炎症。
DPX2减轻肠道炎症后的肝损伤
研究进一步评估了DPX2对肝损伤本身的改善作用。结果显示，DPX2治疗显著降低了肠I/R小鼠血浆中的肝损伤标志物AST和ALT水平。肝脏组织病理学检查（H&E染色）显示，DPX2治疗组小鼠肝脏的空泡化和坏死程度较对照组明显减轻，Suzuki组织损伤评分显著下降。此外，TUNEL染色显示DPX2治疗组肝脏中TUNEL阳性（凋亡）细胞数量显著减少，证实了DPX2能抑制肝细胞凋亡。这些发现综合表明，DPX2能有效减轻肠道炎症引发的肝损伤。
讨论
本研究证实，在肠I/R过程中，IELs启动的中性粒细胞会加剧继发性肝损伤。显微镜下观察到中性粒细胞与IELs在肠黏膜内共定位。被IELs启动的中性粒细胞形成NETs的能力增强，这些细胞富集于门静脉循环并积聚于肝脏。过继转移IEL启动的中性粒细胞会放大肝脏中包括M1极化标志物iNOS、促炎细胞因子和趋化因子在内的炎症相关基因表达。重要的是，靶向CD112–CD226相互作用的CD112衍生肽DPX2，在体外阻断了IEL诱导的NETosis，减少了门静脉NETs，减轻了肝脏炎症和损伤基因的表达及转氨酶水平，并改善了肝损伤的组织学特征。这些发现揭示了中性粒细胞在肠-肝对话中先前未被充分认识的作用，阐明了局部肠道免疫-中性粒细胞相互作用加剧肝损伤的机制轴，并确定CD112介导的信号通路是减轻继发性肝损伤的一个有前景的治疗靶点。
中性粒细胞对炎症介质高度敏感，能迅速迁移至炎症部位。本研究发现了一种新机制：在炎症期间浸润肠道组织的中性粒细胞可通过与IELs（特别是经由CD112–CD226信号）相互作用而被启动。这些具有NET形成表型的启动后中性粒细胞随后通过门静脉系统重新进入循环。这一发现通过观察到门静脉循环中NET阳性中性粒细胞较体循环增多，以及后续NETs在肝组织中积聚得到证实。这符合中性粒细胞反向跨内皮迁移的概念。
NETs的形成主要作为抵御病原体的防御机制，但本研究结果表明，与IELs相互作用诱导的过度NETs产生可能具有病理性。即使NETs捕获了病原体，它们也可能携带病原体在循环中扩散。传统观点认为中性粒细胞在释放NETs后会死亡，但近期研究表明部分中性粒细胞在NETs释放后不会立即死亡，而是保持运动能力以扩大NETs覆盖范围阻止细菌扩散。本研究观察到门静脉中存在迁移的NETotic中性粒细胞，与此新理论一致。
本研究的临床意义在于，CD112衍生肽DPX2能有效减轻由IEL激活的中性粒细胞驱动的继发性肝损伤。尽管全身性皮质类固醇常用于抑制广泛炎症并保护多器官，但其对细胞因子通路的广泛抑制和对中性粒细胞功能的抑制可能增加感染风险。因此，临床医生在考虑使用全身性类固醇预防继发性肝损伤时应谨慎。相比之下，选择性阻断CD112–CD226轴提供了一种靶向策略，因为它阻断了IEL刺激的中性粒细胞的病理性激活，同时保留了宿主防御所需的中性粒细胞基本功能。这种更聚焦的方法可能减少附带性免疫抑制，因此在转化临床应用方面具有相当大的潜力。
尽管AST和ALT在临床上被视为肝脏酶，但它们也可能从受损的肠道平滑肌细胞/组织中泄漏。因此，本研究通过结合血清肝酶、肝组织炎症标志物以及组织学（包括H&E和TUNEL染色）来评估肝损伤。我们承认肠I/R模型可能造成肝脏血流动力学改变，这是潜在的混杂因素。然而，在过继转移模型中，我们清晰地证明了IEL启动的中性粒细胞与对照组中性粒细胞相比，显著加剧了肝脏炎症，而两组小鼠经历了相同的肠I/R手术过程，因此承受了可比的缺血和血流动力学应激。这些结果表明，免疫对话确实是驱动肠I/R诱导肝损伤的关键因素。
众所周知，肠道缺血/再灌注可导致肠道菌群组成和功能的显著改变（即菌群失调）。菌群失调可能通过破坏肠道屏障功能、促进内毒素和其他微生物代谢产物易位进入血液，直接促进全身性炎症并向肝脏传播炎症。尽管本研究未评估肠道菌群，但它表明通过CD112激活的中性粒细胞会发生NETosis并通过门静脉迁移至肝脏，这意味着DPX2减少继发性肝损伤的作用独立于菌群。因此，提出一种不依赖于菌群的、靶向中性粒细胞和IELs启动过程的治疗干预手段，可能是未来治疗的重要进展。
本研究存在一些局限性。首先，缺乏针对多种细胞类型的无偏筛选过程（如多组学分析）。然而，我们的靶向研究方法是近期脓毒症工作的直接和逻辑延伸。其次，DPX2的药代动力学需要进一步研究。尽管腹腔注射1.0 μg/g被证明有效，但仍需研究其剂量-效应关系以确定最佳剂量。此外，虽然评估DPX2的长期治疗效果及其对慢性炎症的影响可能是有必要的，但同样值得注意的是，继发性肝损伤显著影响急性期存活率，且目前对肝损伤的治疗仍属于辅助性。因此，靶向新机制的新药备受期待。最后，本研究完全依赖于动物模型，可能无法完全复制人类病理生理学。尽管动物研究是必要的，但物种间细胞机制可能存在显著差异，可能影响研究结果对人类治疗的适用性。然而，CD112不仅在小鼠中表达，也在人类中表达。因此，在人体（包括人体组织培养和器官芯片模型）中研究本机制和治疗潜力无疑是值得的。
结论
在受损肠道中，由IELs启动的中性粒细胞形成NETs，并通过门静脉循环迁移至肝脏，驱动继发性肝脏炎症和损伤。靶向CD112–CD226相互作用的CD112衍生肽DPX2能抑制NETs形成，减少门静脉和肝脏中的NETs，并改善肝脏炎症和损伤。这些发现阐明了一种肠-肝对话的新细胞机制，并确定CD112信号通路是预防肠道来源肝损伤的一个有前景的靶点。
