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本文通过分析传统小RNA测序数据，深入剖析了炎症性肠病（IBD）患者外周血中tRNA衍生小RNA（tsRNA）、rRNA衍生小RNA（rsRNA）和Y RNA衍生小RNA（ysRNA）的表达谱。研究揭示了这些非经典小非编码RNA（sncRNA）在IBD中整体上调的模式，构建了一个包含21个tsRNA/rsRNA/ysRNA家族的分子标签，在区分健康对照（HC）与IBD患者方面显示出良好的诊断潜力。值得注意的是，尽管其在测序数据中的比例远低于miRNA，但基于tsRNA/rsRNA/ysRNA的标签在不同队列间表现出比miRNA标签更强的稳定性。共表达分析提示，氧化应激升高可能是IBD中这些非经典sncRNA生物合成的共同调控因子。该研究为探索IBD的新型液体活检生物标志物和发病机制提供了新的视角和线索。
背景
小非编码RNA（sncRNA）的研究领域正在迅速扩展。近年来，随着测序技术的革新（如PANDORA-seq、TGIRT-seq和CPA-seq）和生物信息学工具的更新，大量非经典sncRNA被系统地鉴定出来。这些sncRNA源自各种母体RNA（如tRNA、rRNA和Y RNA）的切割，被称为tRNA衍生小RNA（tsRNA）、rRNA衍生小RNA（rsRNA）和Y RNA衍生小RNA（ysRNA）。它们携带多种RNA修饰，因此无法通过传统的sncRNA测序方法系统地发现。重要的是，这些非经典sncRNA在体液中广泛存在，并显示出作为疾病生物标志物的巨大潜力。
尽管方法学不断进步，但大多数现有的sncRNA分析仍使用传统测序协议进行。在这些数据集中，miRNA构成了测序读段的主体，而tsRNA、rsRNA和ysRNA仅能以较小比例被一致地检测到。这引发了一个问题：这些tsRNA、rsRNA和ysRNA是否仍可用于人类疾病的诊断，以及其表现与miRNA相比如何？为了填补这一知识空白，我们重新分析了一个已发表的、样本量相对较大的sncRNA测序数据集，该数据集最初由Juzenas等人用于分析炎症性肠病（IBD）患者外周血中的miRNA表达。IBD是一种由遗传和环境因素驱动的消化道的慢性炎症性疾病，可分为两种亚型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。先前已有研究致力于识别IBD的潜在生物标志物，但主要局限于miRNA。虽然已有讨论其潜力，但迄今为止，尚未有研究尝试解码其他sncRNA（如非经典sncRNA）在IBD诊断和/或治疗中的作用。
方法
本研究利用了来自基因表达综合（GEO）数据库的公开sncRNA测序数据，包括瑞典队列和德国队列。使用Cutadapt工具对原始测序读段的接头进行修剪，并应用SPORTS框架从修剪后的测序读段中总结和注释单个sncRNA，允许零错配。仅保留长度为15-45个核苷酸（nts）的sncRNA种类。tsRNA、rsRNA和ysRNA个体家族和物种的表达水平以每百万读段（RPM）来衡量。使用控制年龄和性别的线性回归模型来筛选差异表达的sncRNA家族。基于优先考虑的sncRNA表达，使用风险评分方案为每个样本分配风险评分。使用DAVID生物信息学工具识别由给定基因集富集的KEGG通路，并使用FAIME算法计算通路评分。所有统计分析均在R编程平台上进行。
结果
IBD中非经典sncRNA的概况
我们首先对瑞典队列的数据进行了分析。与健康对照（HC）样本相比，我们观察到在症状对照（SC）、UC和CD组中，tsRNA丰度分别显著增加，并且SC、UC、CD样本中的rsRNA也出现整体上调。然而，在HC组与其他组之间，未发现总ysRNA丰度有显著变化。tsRNA、rsRNA和ysRNA的总丰度之间存在正相关，这表明这些非经典sncRNA共享一个共同的生物合成机制。我们进一步研究了非经典sncRNA的长度分布。与miRNA不同，tsRNA、rsRNA和ysRNA观察到多个大小峰。tsRNA、rsRNA和ysRNA具有特定的长度峰，并且在四个组（HC、SC、UC和CD）中的长度分布相似，tRNA、rRNA和Y RNA的特定片段化模式可能包含代表其生物合成特定细胞环境的生物信息。
基于其母体RNA对tsRNA/rsRNA/ysRNA种类进行分层后，对这些非经典sncRNA类别的表达进行主成分分析表明，HC组与其他组之间存在不同的表达谱，并且在HC与SC组、HC与UC组以及HC与CD组之间，第一主成分（PC1）存在显著差异。此外，在UC和CD组之间，PC1也存在轻微但显著的差异。为了了解UC和CD组之间sncRNA失调模式的一致性，我们分别计算了所有tsRNA/rsRNA/ysRNA家族在HC与UC样本之间以及HC与CD样本之间的表达倍数变化（FC）。观察到log2转换的FC之间存在强正相关，这表明UC和CD之间tsRNA/rsRNA/ysRNA的生物合成机制高度相似。
IBD中差异表达的tsRNA、rsRNA和ysRNA
由于上述分析表明瑞典队列中UC和CD的所有tsRNA/rsRNA/ysRNA家族具有相似的失调模式，我们进一步使用控制年龄和性别的线性模型，统计研究了差异表达的tsRNA/rsRNA/ysRNA家族。总共鉴定出21个非经典sncRNA家族在UC和CD样本中相较于HC组普遍上调，包括一个rsRNA（rsRNA-12S）、一个ysRNA（ysRNA-RNY3）、十五个GtsRNA（例如GtsRNA-Arg-ACG和GtsRNA-His-GTG）和四个MtsRNA（例如MtsRNA-His-GTG）。有趣的是，相对于HC，在SC组中也发现了这21个非经典sncRNA家族的上调。我们将这21个非经典sncRNA家族指定为21-tsRNA/rsRNA/ysRNA标签。
我们还通过1000轮五折交叉验证评估了tsRNA/rsRNA/ysRNA在瑞典队列中的分类能力。每轮交叉验证中，计算基于优先考虑的tsRNA/rsRNA/ysRNA家族的风险评分，并通过计算HC与UC样本之间以及HC与CD样本之间的曲线下面积（AUC）来评估风险评分的分类能力。结果显示，对于HC与UC的分类，平均AUC中位数为0.796；对于HC与CD的分类，平均AUC中位数为0.874。此外，在1000轮交叉验证中，21-tsRNA/rsRNA/ysRNA标签中的几乎所有sncRNA家族都最有可能被优先考虑。所有这些结果表明tsRNA/rsRNA/ysRNA在IBD中具有良好的诊断潜力。
非经典sncRNA与基因的共表达
为了系统理解非经典sncRNA与转录组谱之间的关系，我们研究了瑞典队列中tsRNA/rsRNA/ysRNA与基因之间的共表达模式。使用Spearman等级相关性检验，计算了个体tsRNA/rsRNA/ysRNA家族与基因之间的表达配对关系。共表达最强的前几位sncRNA-基因对显示，GtsRNA-Pro-AGG、rsRNA-16S和ysRNA-RNY3与HNRNPCL2、HAX1和SCX（分别参与转录、RNA结合和核糖体组装）呈正共表达；而MtsRNA-Val-TAC、rsRNA-16S和ysRNA-RNY3与CSF2RB、PLCL2和SNX1（分别参与炎症、自身免疫性疾病和内体到溶酶体的分子运输）呈负共表达。
我们进一步研究了与tsRNA/rsRNA/ysRNAs共表达的基因所富集的通路。这里仅考虑与至少20个sncRNA家族正共表达或负共表达的基因。总共鉴定出204个和755个基因分别与tsRNA/rsRNA/ysRNA正共表达和负共表达。正共表达的基因与氧化应激反应相关的KEGG通路显著相关，包括“氧化磷酸化”和“化学致癌-活性氧”，其中氧化应激升高是增加tRNA/rRNA片段化的潜在因素。相比之下，负共表达的基因与更多样化的KEGG通路显著相关，例如“内吞作用”、“癌症中的通路”、“神经营养因子信号通路”、“Notch信号通路”、“鞘脂信号通路”和“FoxO信号通路”。此外，我们发现与非经典sncRNA正共表达的通路评分在SC和IBD样本中显著高于HC。相反，与tsRNA/rsRNA/ysRNA负共表达的通路评分在SC和IBD组中显著较低。
IBD中tsRNA/rsRNA/ysRNA与miRNA的比较
首先，基于上述21-tsRNA/rsRNA/ysRNA标签的表达，为每个样本计算了IBD风险评分。同时研究了瑞典队列和德国队列。与HC样本相比，瑞典队列中IBD样本的风险评分显著更高。此外，CD组的风险评分略高于但显著高于UC组。用于组分类的ROC曲线显示，HC与UC组之间的AUC为0.813，HC与CD组之间的AUC为0.918。然而，如果我们观察德国队列中接受治疗的患者样本，IBD患者的风险评分显著恢复到基线水平，尽管UC样本的风险评分略高于HC。同时，德国队列仅显示两个非经典sncRNA家族在UC和CD样本中普遍失调，这远少于瑞典队列。这些结果表明，21-tsRNA/rsRNA/ysRNA标签的诊断信号在接受治疗的患者中减弱了。
我们进一步调查了miRNA在瑞典队列中的分类能力。总共鉴定出25个miRNA在UC和CD样本中相较于HC组普遍上调或下调，这被指定为25-miRNA标签。同样基于这个25-miRNA标签为每个样本计算了风险评分。不出所料，在瑞典队列中，IBD患者的基于miRNA的风险评分显著高于HC。对于HC与UC的分类，21-tsRNA/rsRNA/ysRNA和25-miRNA标签的ROC曲线的AUC没有显著差异，而对于HC与CD的分类，则观察到边际差异。
有趣的是，当我们比较瑞典和德国队列之间基于25-miRNA的风险评分时，我们注意到德国队列的基线评分与瑞典队列相比出现了整体偏移：德国队列中HC样本的基于25-miRNA的风险评分显著高于瑞典队列中的HC，这表明基线miRNA表达模式的队列差异比非经典sncRNA更强。此外，对于HC样本，两个队列之间tsRNA/rsRNA/ysRNA表达的关系比miRNA更线性，并且miRNA的队列差异比非经典sncRNA的差异大得多。因此，在HC样本中观察到的跨队列稳定性表明，与miRNA相比，tsRNA/rsRNA/ysRNA可能作为一种技术上更稳健的生物标志物，因为后者在队列之间表现出显著的基线偏移。
讨论
虽然之前的研究已经全面调查了IBD外周血中的全基因组mRNA和miRNA表达，但在这里我们关注了一组非经典sncRNA，包括tsRNA、rsRNA和ysRNA。在IBD患者中观察到这些非经典sncRNA的系统性上调，提示tsRNA/rsRNA/ysRNA在IBD中的生物合成增强和潜在的诊断能力。
我们研究的一个重要发现是，尽管tsRNA、rsRNA和ysRNA在传统sncRNA测序数据集中的比例远低于miRNA，但它们足以区分IBD患者和HC。特别是，tsRNA/rsRNA/ysRNA在跨队列分析（即瑞典和德国队列）的基线表达水平上表现出更好的稳健性，而基于miRNA的标签在两个队列之间显示出基线水平的显著偏移，这突出了在涉及多中心队列时使用基于tsRNA/rsRNA/ysRNA标签的优势。
为什么tsRNA/rsRNA/ysRNA谱比miRNA在不同队列间更稳定？答案可能在于它们不同的生物合成途径。miRNA的生物合成涉及相对简单和确定的酶（核内的Drosha和细胞质中的Dicer），而tsRNA、rsRNA和ysRNA的生物合成则源于其母体RNA被更广泛的RNase（例如RNase A、L、T2和Z）进行差异切割。RNase切割活性进一步受到位点特异性RNA修饰的调节，而这些修饰又受到至少数十种酶的严格控制。因此，tsRNA/rsRNA/ysRNA的最终谱代表了多种酶的复杂组合，其中许多酶（RNase和RNA修饰酶）在进化上比Drosha和Dicer更古老。这些古老的酶作为许多生物过程的基础，在跨队列分析中可能较少受到遗传背景的影响。
有趣的是，氧化应激是IBD的一个关键特征，并且氧化应激增加已被发现是影响单细胞生物和哺乳动物细胞中tsRNA/rsRNA/ysRNA生物合成的潜在因素，促进tRNA/rRNA/Y RNA切割成片段。这与在CD、UC和SC组中观察到的氧化应激反应增加以及它们在瑞典队列中类似的tsRNA/rsRNA/ysRNA谱增加相呼应。（SC组可能包括细菌感染患者，因此也表现出炎症和氧化应激增加。）在德国队列中，接受治疗的CD和UC组的tsRNA/rsRNA/ysRNA谱恢复到正常水平，这可能是由于炎症和氧化应激得到控制，尽管我们缺乏德国队列的直接转录组数据来支持这一点。
另一方面，在CD、UC和SC组内观察到的tsRNA、rsRNA和ysRNA的类似失调也可能是由于传统sncRNA测序的方法学限制，因为许多高度修饰的tsRNA/rsRNA/ysRNA无法包含在测序文库中。当使用更先进的测序方法（如PANDORA-seq）时，将揭示来自修饰的tsRNA/rsRNA/ysRNA的更多层信息，可能区分IBD亚组（即CD与UC）和SC组。这个方向值得未来研究。本研究的另一个局限性在于缺乏在独立队列中对基于tsRNA/rsRNA/ysRNA的标签进行验证。德国队列的患者接受了治疗，这使得该数据集不适合用于验证目的。未来在其他IBD队列中的研究可能进一步加深我们对21-tsRNA/rsRNA/ysRNA标签分类性能的理解。
最后，一个有趣的问题是，在IBD中观察到的tsRNA/rsRNA/ysRNA谱变化是否仅仅代表细胞变化的结果，或者这种改变的sncRNA标签能否进一步触发持续的炎症和IBD的进展。IBD是一组自身免疫性疾病，其中Toll样受体7/8（TLR7/8）介导的先天免疫功能障碍深度参与。TLR7和TLR8是X连锁的IBD易感基因。最近的研究表明，tsRNA、rsRNA和ysRNA直接参与触发TLR7/8的激活。在IBD患者血液中发现的异常升高的tsRNA/rsRNA/ysRNA水平表明，tsRNA/rsRNA/ysRNA可能通过细胞外囊泡（EV）在整个系统中运输，细胞外囊泡已知携带各种tsRNA/rsRNA/ysRNA，并可能异位触发TLR7/8来启动或维持炎症状态。这个想法与最近的提议非常吻合，即许多tsRNA/rsRNA/ysRNA可以发挥超出RNA干扰的功能，并且独立于Argonaute蛋白，而是利用其二级和三级结构以适体样的方式与各种蛋白质相互作用。更深入地理解这些sncRNA-TLR相互作用可能会带来对疾病病因学更好的机制见解，并最终产生治疗IBD的新治疗手段。除了检测血液sncRNA，未来的探索还可以检测其他生物体液，甚至粪便中的sncRNA，以检查更直接反映胃肠道隔室的变化。
结论
我们揭示了UC、CD和SC组与HC相比，非经典sncRNA的整体上调，这是先前未被探索的。有趣的是，尽管这些公开数据集是由传统sncRNA测序协议生成的，其中miRNA占主体，但剩余的tsRNA/rsRNA/ysRNA仍然可以有效区分健康对照和IBD患者，并且在跨队列稳健性方面优于miRNA。此外，我们对tsRNA/rsRNA/ysRNA与基因之间的共表达分析表明，氧化应激反应升高可能是非经典sncRNA谱改变的共同调节因子。
