《Molecular Medicine》：Targeting macrophage glycogen metabolism attenuates ulcerative colitis by suppressing IL-1β production through UDPG-P2Y14 signaling
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本研究创新性地揭示了巨噬细胞糖原代谢在溃疡性结肠炎（UC）中的关键作用，提出通过靶向糖原代谢中间产物UDPG及其受体P2Y14，可有效抑制巨噬细胞中IL-1β的转录与分泌，为治疗UC及其他IL-1β驱动的炎症性疾病提供了新的潜在治疗靶点。
引言
溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性的、非特异性的结肠和直肠炎症性疾病，其特征是黏膜炎症的反复发作。在疾病进展过程中，巨噬细胞被募集到肠道固有层，并向促炎表型极化，通过分泌细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α加剧组织损伤。其中，IL-1β发挥着核心作用，其免疫调节和促炎功能与疾病严重程度相关。巨噬细胞的炎症表型受到葡萄糖代谢的强烈影响。除糖酵解外，既往研究表明巨噬细胞也利用糖原代谢来支持其生存和促进炎症激活。然而，糖原代谢如何调节巨噬细胞中IL-1β的转录表达和蛋白水解成熟仍不清楚。
结果
1. 炎症巨噬细胞糖原含量与溃疡性结肠炎中IL-1β水平呈正相关
为了探究巨噬细胞糖原含量与IL-1β水平之间的相关性，研究收集了轻、中、重度UC患者的结肠组织样本。组织学分析显示炎症细胞浸润逐渐增加，并伴有重度UC病例发炎黏膜中IL-1β水平的升高。利用淀粉结合域蛋白1（STBD1）可视化糖原水平，观察到炎症巨噬细胞中糖原逐渐积累，这与观察到的iNOS表达增加相平行。值得注意的是，更高的IL-1β表达与更显著的糖原积累和更强的疾病严重程度相关。为了进一步探索这一点，研究使用C57BL/6 J小鼠建立了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型。DSS处理的小鼠表现出剂量依赖性的体重下降、更高的疾病活动指数评分以及显著的结肠缩短。组织学评估显示DSS处理小鼠的隐窝丢失、上皮损伤和炎症浸润更严重。与人类数据一致，结肠黏膜中IL-1β表达上调，并与炎症巨噬细胞中的糖原积累呈正相关。进一步分析证实，在鼠结肠炎中，炎症巨噬细胞的糖原含量与疾病进展和IL-1β水平呈正相关。
2. 糖原代谢衍生的UDPG调节炎症巨噬细胞中IL-1β的表达
研究证实炎症巨噬细胞表现出活跃的糖原代谢。为了探究糖原代谢是否有助于IL-1β的调节，研究培养了小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）并用干扰素γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）刺激以诱导炎症表型。通过siRNA介导的敲低Pgm1、Ugp2或Pygl，或通过糖原磷酸化酶抑制剂（GPI）处理来阻断糖原代谢，导致IL-1β表达下降，表明糖原代谢通量是炎症巨噬细胞产生IL-1β所必需的。值得注意的是，抑制糖原合成产生了相反的效果。敲低Gys1增加了IL-1β的产生，而用Gsk-3β抑制剂HY-13973A增强Gys1活性则降低了IL-1β水平。由于Ugp2将葡萄糖-1-磷酸转化为UDPG，而Gys1消耗UDPG合成糖原，研究假设UDPG水平可能是这些不同结果的基础。同位素标记显示，敲低Pgm1、Ugp2或Pygl后，M+6 UDPG水平下降，但在Gys1 siRNA处理后增加。此外，外源性UDPG不仅增强了炎症巨噬细胞中IL-1β的产生，而且在抑制糖原降解后恢复了IL-1β水平。这些发现表明，糖异生过程中产生的UDPG正向调节IL-1β表达。
3. UDPG通过P2Y14-STAT1信号通路调节炎症巨噬细胞中IL-1β的表达
IL-1β的生物合成和分泌受双信号机制调控：启动信号诱导pro-IL-1β的合成，第二信号激活炎症小体，导致caspase-1依赖性切割和成熟IL-1β的释放。研究证实UDPG上调了炎症巨噬细胞中Il1b的转录表达。STAT1是参与介导巨噬细胞炎症表型的关键转录因子。研究显示，在经GPI处理的炎症巨噬细胞中，STAT1的表达和磷酸化水平降低，但在UDPG处理后增强。此外，敲低Stat1下调了IFN-γ/LPS刺激的巨噬细胞中Il1b的表达。生物信息学分析结合染色质免疫沉淀（CHIP）和定量PCR（ChIP-qPCR）证实，磷酸化的STAT1直接结合到Il1b启动子上。荧光素酶报告基因检测结果进一步验证了STAT1驱动的Il1b反式激活。这种结合被GPI完全抑制，并被UDPG处理增强。这些发现表明糖原代谢通过转录因子STAT1调节Il1b表达。UDPG通过分泌途径从高尔基体释放到细胞外空间，在那里与受体P2Y14结合，在炎症巨噬细胞中启动信号传导。P2Y14在人类结肠炎症组织样本来源的巨噬细胞中高表达，暗示其参与UDPG调节的IL-1β表达。用PPTN抑制P2Y14显著下调了Il1b表达，并完全阻止了STAT1与Il1b启动子的结合。使用P2ry14特异性siRNAs获得了类似的结果。此外，使用特异性siRNAs排除了其他UDPG相关嘌呤能受体（如P2ry2和P2ry6）的贡献。外源性UDPG未能恢复Stat1或P2ry14敲低的巨噬细胞中的IL-1β表达。此外，来自P2ry14-/-小鼠的BMDMs在IFN-γ/LPS刺激下表现出降低的Il1b表达。这些结果表明，UDPG由巨噬细胞分泌，并通过P2Y14传递信号，经由STAT1转录途径调节炎症巨噬细胞中Il1b的表达。14-STAT1通路调节结肠炎巨噬细胞IL-1β表达，展示了STAT1磷酸化、其与Il1b启动子的结合、以及P2Y14受体敲除或抑制对通路的影响。">
4. UDPG通过P2Y14-cAMP-NLRP3通路促进IL-1β释放
NLRP3炎症小体和ASC的组装导致caspase-1激活，从而切割pro-IL-1β并促进IL-1β的成熟和释放。为了研究糖原代谢是否影响炎症巨噬细胞中IL-1β的释放，研究使用靶向Pgm1、Ugp2或Pygl的siRNAs或GPI处理来降低UDPG水平。这些干预措施抑制了活性caspase-1和IL-1β的水平。相反，敲低Gys1或暴露于外源性UDPG增强了活性caspase-1和IL-1β的表达。此外，NLRP3-ASC斑点形成的直接证据或caspase-1活性检测证实了这些结果。这些处理均未改变NLRP3或ASC的表达，表明糖原代谢调节的是NLRP3和ASC的组装，而非其表达。先前研究表明P2Y14通过调节cAMP来促进caspase-1和IL-1β的激活，从而影响NLRP3-ASC复合物的形成。与此一致的是，研究发现siRNA介导的P2ry14敲低降低了炎症巨噬细胞中活性caspase-1和IL-1β水平，同时升高了cAMP。同样，通过Pgm1、Ugp2或Pygl siRNA或GPI处理降低UDPG表达增加了cAMP水平，而Gys1敲低或外源性UDPG处理则降低了cAMP水平。重要的是，在来自P2ry14-/-小鼠的BMDMs中，外源性UDPG无法降低cAMP水平。这些结果表明UDPG通过P2Y14-cAMP-NLRP3信号通路调节IL-1β的活化。14-cAMP-NLRP3通路促进IL-1β释放，展示了不同干预下caspase-1活性、IL-1β成熟及cAMP水平的变化。">
5. 阻断巨噬细胞糖原代谢有效抑制DSS诱导的小鼠结肠炎
鉴于糖原代谢在炎症巨噬细胞IL-1β产生中的调节作用，研究假设抑制糖原代谢可能减少IL-1β分泌，从而改善DSS诱导的UC。为了验证这一假设，使用2.5% DSS建立了UC小鼠模型，并评估了GPI的治疗潜力。接受DSS暴露的小鼠分别用10 μg/g GPI或生理盐水（对照组）处理。GPI给药显著缓解了结肠炎症状，表现为体重下降减少、疾病活动指数降低以及结肠缩短减轻。此外，苏木精-伊红（H&E）染色显示，GPI处理显著改善了DSS诱导的结构异常，包括结肠壁增厚、杯状细胞丢失和炎症细胞浸润。DSS攻击还导致脾脏重量增加，这与全身性炎症和贫血有关。值得注意的是，GPI处理显著减轻了脾脏肿大。此外，GPI降低了结肠炎组织中Ki67的表达，表明抑制了过度的细胞增殖。与假设一致，GPI处理有效减少了炎症巨噬细胞的浸润，并降低了结肠组织中的IL-1β表达。ELISA进一步证实，GPI干预后肠道培养上清液中的IL-1β水平降低。为了确定GPI的治疗效果是否依赖于体内的巨噬细胞和IL-1β，研究使用氯膦酸盐脂质体（Clod）耗竭了腹腔巨噬细胞。巨噬细胞耗竭减轻了DSS诱导的体重下降、结肠缩短和肠道炎症，并且还导致了IL-1β分泌减少，这与GPI处理观察到的效果相似。此外，这些发现在由1% DSS诱导的慢性UC模型中得到了验证，通过GPI干预靶向糖原代谢也能有效改善慢性UC。这些结果表明，抑制炎症巨噬细胞中的糖原代谢能抑制IL-1β的表达和释放，最终减轻DSS诱导的UC。
6. GPI治疗促进肠上皮再生
肠道屏障的完整性受到局部微环境炎症状态的影响。先前研究已确定IL-1β是动态调节肠道屏障功能的关键效应分子。研究发现GPI治疗在结肠炎进展过程中抑制了肠道炎症浸润，从而可能减轻IL-1β介导的肠道屏障损伤。研究进一步使用阿尔新蓝和过碘酸-雪夫（PAS）染色评估了杯状细胞密度。与上述发现一致，与DSS组相比，GPI给药增加了杯状细胞的丰度，表明小鼠的肠道黏液屏障功能得到恢复。之前的报告表明，DSS诱导的结肠炎导致claudin-1和occludin的表达抑制，它们是紧密连接的关键组成部分，也是肠道黏膜屏障完整性的关键指标。免疫荧光分析表明，GPI处理显著上调了DSS诱导结肠炎小鼠的claudin-1和occludin表达。这些结果表明，在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，GPI治疗改善了肠道炎症并增强了屏障功能。
讨论
来自人类标本和鼠结肠炎模型的积累证据表明，IL-1β的过度产生在UC的发病机制中起着关键作用。巨噬细胞在调节胃肠道炎症中的作用日益被认识。细胞代谢严重影响免疫细胞的命运和功能，这表明靶向免疫代谢可能为炎症性疾病提供新的治疗策略。传统上被视为肝细胞和肌细胞中葡萄糖储备的糖原，在免疫调节中扮演着新兴的角色。考虑到巨噬细胞和IL-1β在UC中的核心作用，研究假设调节巨噬细胞中的糖原代谢可以影响IL-1β的产生并减轻结肠炎。研究显示，巨噬细胞中的糖原含量与UC患者的疾病进展和DSS诱导结肠炎的严重程度相关。同时，研究证明了糖原水平与IL-1β表达呈正相关。考虑到巨噬细胞中糖原代谢的高活性，与上皮细胞和基质细胞相比，靶向巨噬细胞糖原代谢是UC干预的相对合理的方法。这些发现表明，靶向巨噬细胞糖原代谢可能是减少IL-1β产生和改善UC的可行策略。
研究先前报道，糖原代谢产生UDPG，其激活P2Y14受体，从而调节巨噬细胞中的炎症基因表达。在本研究中，研究阐明了巨噬细胞来源的UDPG通过P2Y14信号传导促进IL-1β表达的机制。P2Y14是一种被细胞外核苷和UDP-糖激活的G蛋白偶联受体，其配体效力顺序为UDPG > UDP-半乳糖 > UDP-葡萄糖醛酸 > UDP-N-乙酰葡糖胺。值得注意的是，UDPG作为一种损伤相关分子模式在损伤部位释放，暗示UDPG–P2Y14轴参与了炎症反应。研究结果表明，该通路也激活了STAT1，为IL-1β的调节提供了潜在机制。此外，IL-1β的成熟需要通过炎症小体组装（特别是涉及NLRP3和ASC）来激活caspase-1。先前研究表明，P2Y14–cAMP信号传导促进急性痛风性关节炎中的NLRP3炎症小体激活。与此一致，研究数据显示UDPG–P2Y14信号传导提高了cAMP水平，增强了IL-1β的产生，并促进了NLRP3炎症小体的组装。使用GPI抑制糖原分解减少了炎症细胞浸润，降低了IL-1β表达，并在实验性结肠炎中发挥了保护作用。
总之，研究证明糖原代谢的中间产物UDPG由巨噬细胞分泌并与P2Y14结合。这一信号级联通过STAT1通路促进IL-1β表达，并通过P2Y14–cAMP–NLRP3轴促进IL-1β的成熟。与这些发现一致，P2Y14敲除抑制了IL-1β的产生并抑制了NLRP3炎症小体的组装。本研究揭示了糖原代谢在调节IL-1β中先前未被认识到的作用，并为在肠道炎症中靶向该通路提供了机制基础。
