《Journal of Plant Diseases and Protection》：Detection of the F129L mutation in the cytochrome b gene of Phyllosticta citricarpa and reduced sensitivity to quinone-outside inhibitor fungicides
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为了解决柑橘黑斑病（CBS）防治中醌外抑制剂（QoI）类杀菌剂因靶点单一而面临潜在的抗性风险问题，研究人员首次针对南非柑橘园中病原菌Phyllosticta citricarpa细胞色素b（cytb）基因的突变情况及其对田间药效的影响开展研究。结果表明，cytb基因的F129L突变与吡唑醚菌酯和嘧菌酯对CBS的防效降低显著相关，且双倍剂量亦无法完全恢复防效。此研究首次报告了该病原菌中F129L突变及对QoI类杀菌剂的敏感性变化，对抗性监测与管理具有重要指导意义。
想象一下，一片阳光普照的南非柑橘园，挂满了饱满的柠檬和橙子，这本该是丰收的景象，但果农们却忧心忡忡，因为一种名为“柑橘黑斑病”（Citrus Black Spot, CBS）的真菌病害正悄然蔓延。这种由真菌Phyllosticta citricarpa引起的病害，会在果实表面留下难看的黑色斑点，严重影响果实的商品价值。为了保护果实免受感染，果农们高度依赖一类称为“醌外抑制剂”（Quinone-outside inhibitors, QoIs）的杀菌剂，例如吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和嘧菌酯（azoxystrobin）。这类杀菌剂作用位点专一，自21世纪初以来在南非柑橘园中被广泛使用，效果显著。然而，也正是由于其作用靶点单一，病原菌容易通过基因突变产生抗药性，这已成为全球植物病害防治中一个令人担忧的普遍问题。那么，长期使用QoI杀菌剂的南非柑橘园里，致病菌P. citricarpa是否已经“进化”出了抗药性呢？这正是研究人员想要探明的核心问题。这项研究最终发表于《Journal of Plant Diseases and Protection》上。
为了探寻答案，研究人员采用了一套组合研究方法。他们首先从2018年至2024年间，从南非多个省份的商业柑橘园中，收集了自然感染CBS的柑橘果实样本，共分离获得了191株P. citricarpa菌株。在实验室中，研究人员采用了分子生物学技术，设计并使用了特异性引物（如Cytb 11/Cytb 12和Cytb 7/Cytb 8），通过聚合酶链式反应（PCR）扩增并测序分析了每个菌株细胞色素b（cytochrome b, cytb）基因的关键区域，该基因是QoI类杀菌剂的作用靶点，重点关注了与抗性相关的第129、137和143位密码子。为了评估发现的突变在田间实际防治中的影响，研究团队在2024-2025年生长季，选择了一个历史上CBS发病压力高、且已确认其病原菌群体100%携带特定突变的尤力克柠檬园，进行了严格的田间药效试验。他们设置了包含不同杀菌剂组合（如QoI单用、QoI与保护性杀菌剂混用、仅用保护性杀菌剂等）的多组处理，使用高压喷雾器进行施药，并在收获时系统评估了各处理对CBS的防治效果。
Cytb扩增与测序
通过PCR和测序，研究人员在191株P. citricarpa菌株中，成功扩增并分析了cytb基因片段。分析结果显示，所有测试菌株在第137位（GGT，甘氨酸）和第143位（GGT，甘氨酸）密码子均未发生突变，表明G137R和G143A突变在这些南非菌株中不存在。然而，在第129位密码子，73株菌株（占测试总数的38.2%）检测到了突变。其中，69株菌株的密码子由TTC突变为TTA，另外4株由TTC突变为CTC。这两种突变都导致了氨基酸由苯丙氨酸（Phenylalanine）变为亮氨酸（Leucine），即F129L突变。这些携带F129L突变的菌株来自柠檬、葡萄柚和瓦伦西亚橙等多种柑橘类型，且在某些果园中突变检出率高达100%。
QoI的田间药效
田间试验结果明确显示，杀菌剂处理对CBS的防治效果存在极显著差异。当吡唑醚菌酯或嘧菌酯按照行业标准，即与保护性杀菌剂代森锰锌（mancozeb）及矿物油混合施用时，仍能取得较好的防治效果。然而，当这两种QoI杀菌剂仅与矿物油混合使用（即未按注册要求与另一作用机制的杀菌剂混用）时，其防治CBS的效果显著降低。单独使用代森锰锌或王铜（copper oxychloride）的防治效果最好，无病症果实比例分别高达99.4%和97.4%。此外，研究还发现，在单独使用QoI时，吡唑醚菌酯的防效总体优于嘧菌酯。当将QoI的施用剂量加倍时，防效仅有小幅提升，但仍远未达到在敏感（野生型）病原菌群体上使用推荐剂量所能达到的防治水平。这表明，携带F129L突变的P. citricarpa菌株对QoI杀菌剂产生了剂量反应，但敏感性已明显降低。
讨论
本研究首次报告了在P. citricarpa病原菌群体中检测到cytb基因的F129L突变，并证实了该突变与对QoI类杀菌剂敏感性降低（即防效下降）之间存在强关联。与先前研究一致，本研究也未检测到G143A突变，这归因于P. citricarpa的cytb基因在第143位密码子后存在一个I型内含子，该结构阻碍了G143A突变的发生。F129L突变在南非多个柑橘产区和多种柑橘类型中被检测到，且以TTC到TTA的核苷酸替换为主，表明该突变很可能是在不同地点独立发生，并在QoI杀菌剂的选择压力下逐渐增多的。
研究表明，在P. citricarpa中，F129L突变的影响不容小觑。虽然在一些其他病原菌（如Pyrenophora teres）中，F129L被视为次要抗性机制，对田间药效影响不大，但在本研究的柠檬园中，该突变导致了QoI单用时的防效显著下降。这与在Alternaria solani和Rhizoctonia solani等病原菌中的报道相似。此外，吡唑醚菌酯受F129L突变的影响似乎略小于嘧菌酯。
这项研究的结论具有重要的实践指导意义。它证实了即使对于被评估为具有中等抗性风险的病原菌，长期单一使用或不当使用QoI类杀菌剂，仍可能通过F129L等“次要”突变导致田间防效的实质性下降。研究结果强烈支持并强调了严格按照杀菌剂标签说明进行施用的必要性，即QoI类杀菌剂必须与不同作用机制（如FRAC分组不同）的杀菌剂（如保护性杀菌剂）混合使用，以延缓抗性的产生和发展。对于已检测到F129L突变的果园，需要加强抗性监测并调整防治策略。当前，像代森锰锌和王铜这类保护性杀菌剂虽然防效优异，但因其持效期短、无内吸治疗作用，以及存在使用限制（如欧盟对代森锰锌的限制）或潜在药害（如铜制剂引起的果面灼伤）等问题，无法完全替代QoI。因此，在抗性管理框架下，科学、合规地使用QoI，并探索和引入新的、不同作用机制的杀菌剂，对于可持续控制柑橘黑斑病、保障柑橘产业健康发展至关重要。
