《Journal of Plant Diseases and Protection》：Species reassignment and rapid molecular detection of Colletotrichum associated with persimmon anthracnose in Brazil
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为解决精准鉴定巴西柿炭疽病病原菌、实现快速诊断的管理难题，研究人员通过多基因系统发育分析厘清了部分菌株的物种归属，并针对C. horii、C. chrysophilum、C. nymphaeae及C. melonis开发了基于TUB2基因的特异性PCR引物。该研究为柿园病害管理提供了高效工具，并可拓展应用于其他寄主的病原检测。
香甜可口的柿子，近年来在全球许多产区遭遇了严重挑战，其罪魁祸首是一种名为炭疽病的真菌性病害。果实出现病斑、腐烂，甚至在果园中过早脱落，给果农造成了巨大的经济损失。在巴西，柿产业尤为显著地受到冲击，例如在巴拉那州，2012年至2022年间因病害压力等因素导致产量下降了约50%，部分种植者甚至开始重新评估种植柿子的经济可行性。
导致这场“灾难”的元凶是炭疽菌属（Colletotrichum）的真菌，它们主要隶属于Colletotrichum gloeosporioides物种复合体（CGSC）和C. acutatum物种复合体（CASC）。准确识别病原菌的具体物种，对于制定有效的病害管理策略至关重要。因为不同物种在杀菌剂敏感性、酶活性及致病力等方面可能存在差异。然而，传统上基于形态学的鉴定方法并不可靠，而基于多基因测序的系统发育分析方法虽然精准，却耗时、耗力且成本高昂，难以在日常监测和快速诊断中广泛应用。更复杂的是，近年的分类学修订使得一些物种的身份变得模糊，例如此前在巴西柿园和苹果园中报道的C. fructicola，有研究指出其中部分可能应被重新归类为C. chrysophilum。这种不确定性为病害的精准溯源和防控带来了挑战。
因此，为了澄清巴西柿炭疽病菌的物种身份，并为病害的快速诊断提供实用工具，一项聚焦于巴西柿炭疽病病原的研究应运而生。研究团队开展了一项系统性的工作，旨在解决两个核心问题：其一，利用多基因系统发育分析，重新评估先前被鉴定为C. fructicola的菌株的真实分类地位；其二，开发并验证能够快速检测巴西柿炭疽病主要病原菌物种的特异性PCR引物。
研究者们为解答上述问题，采用了几个关键的技术路径。首先，他们构建了一个包含192个炭疽菌分离株的研究样本队列，其中183个分离自巴西四个主要柿产区（圣保罗、巴拉那、圣卡塔琳娜和南里奥格兰德州）的患病组织，另外9个分离自苹果和梨。其次，他们利用多基因系统发育分析（基于ITS、GAPDH和TUB2序列）对存疑菌株进行了物种界定。最后，基于TUB2基因序列的高度可变区，他们设计了针对C. horii、C. chrysophilum、C. nymphaeae和C. melonis这四种病原的物种特异性引物，并通过常规PCR对所有分离株进行了验证，评估了其特异性和在跨寄主检测中的适用性。
研究结果揭示了以下几个重要发现：
巴西柿炭疽病症状中先前被鉴定为Colletotrichum fructicola的分离株属于Colletotrichum chrysophilum物种
通过基于ITS、GAPDH和TUB2序列的多基因系统发育分析，研究人员发现，七个先前被鉴定为C. fructicola的分离株（六个来自柿树，一个来自苹果树）在进化树上均聚集在C. chrysophilum的模式菌株分支内，并获得了高度的统计支持（后验概率PP=0.93，超快自展支持值UFBoot=98）。这一结果明确表明，这些菌株应被重新归类为C. chrysophilum。这一发现解决了因分类更新带来的物种身份模糊问题，更新了巴西柿炭疽病的病原名录。
常规PCR物种特异性引物的验证
在澄清物种身份的基础上，研究人员成功开发了四对物种特异性PCR引物（表3）。
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引物特异性：实验验证表明，每对引物均能特异性扩增其目标物种，产生预期大小的条带（如C. horii为311 bp，C. chrysophilum为206 bp），且在与非目标物种的测试中未出现交叉反应（图3）。
- 2.
种群结构分析：利用这些引物对183个柿树分离株进行检测，揭示了巴西柿炭疽病菌的种群结构。C. horii是绝对优势种，占总分离株的76%。在巴拉那、圣卡塔琳娜和南里奥格兰德州，其比例甚至超过90%。而在圣保罗州，物种构成更为多样，C. nymphaeae最为常见（45%），其次是C. horii（41%）和C. chrysophilum（14%）。C. melonis在所有地区均较少见（图4）。
- 3.
跨寄主适用性：这些引物也被证明能有效识别来自其他寄主（苹果和梨）的相关炭疽菌分离株，显示出其应用潜力不仅限于柿子（图5）。
- 4.
局限性：值得注意的是，为C. melonis设计的引物对与其亲缘关系极近的C. limetticola发生了交叉扩增。这表明，在可能存在多种近缘物种的复杂生态系统中（如苹果园），仍需结合多基因测序进行最终确认。但对于柿子这一特定寄主，由于C. limetticola并非其病原，因此该引物在柿炭疽病诊断中仍然有效。
归纳研究结论和讨论部分，其重要意义在于：
本研究通过严谨的系统发育分析，澄清了巴西柿炭疽病菌中部分C. fructicola菌株应被重分为C. chrysophilum，更新了该病害的病原学认知。更重要的是，研究成功开发并验证了针对C. horii、C. chrysophilum、C. nymphaeae和C. melonis的物种特异性PCR引物。这些引物不仅为巴西柿炭疽病的快速、准确诊断提供了首个实用工具，还能辅助检测其他果树（如苹果、梨）上的相关病原，有助于理解同一农业生态系统中不同寄主间病原菌的交叉侵染动态。
论文讨论部分强调，与需要测序和多基因比对的传统方法相比，这种基于常规PCR的检测方法大大降低了时间和经济成本，更适用于田间样本的大规模筛查和病害监测，从而支持更及时的管理决策。研究揭示的地区间病原种群差异（如圣保罗州以C. nymphaeae为主，而南部各州以C. horii为绝对优势）也提示，未来的病害防控策略可能需要根据不同产区的优势病原物种进行微调，例如选择更具针对性的杀菌剂。
该研究发表在《Journal of Plant Diseases and Protection》上，其成果不仅对巴西柿产业的可持续发展具有直接的实践价值，也为其他面临类似炭疽菌病害诊断挑战的作物体系提供了方法学参考。尽管引物在区分极近缘物种方面存在局限，但作为一套在目标路径中经过大规模验证的初筛工具，它们无疑将显著提升炭疽病诊断的效率和可及性，是连接基础病原研究与田间应用管理的一座重要桥梁。
