《Drug Delivery and Translational Research》：Comparative analysis of clinically approved lipid nanoparticles for intranasal siRNA delivery against SARS-CoV-2
编辑推荐：
为解决当前抗SARS-CoV-2治疗方法的局限性（如药物相互作用、肝脏毒性、病毒变异逃逸等），研究人员开展了针对呼吸道递送抗病毒小干扰RNA（siRNA）的脂质纳米颗粒（LNP）平台比较研究。他们评估了三种模拟已获批药物（Onpattro?、Spikevax?、Comirnaty?）配方的LNP，发现基于MC3（Onpattro?）的LNP-siRNA在呼吸道上皮细胞中递送效率高，能有效抑制病毒，且引发的脱靶免疫激活最小，化学修饰（2′-O-甲基化）可进一步降低免疫原性。体内实验证明其鼻内给药耐受性良好。该研究表明，LNP递送的化学修饰siRNA是应对新冠病毒变异的一种有效且安全的治疗策略。
在全球疫苗接种策略已成功实施的背景下，SARS-CoV-2仍在持续传播并导致住院。尽管已有帕克斯洛维德（Paxlovid?）、瑞德西韦（Veklury?）和莫努匹拉韦（Lagevrio?）等抗病毒药物以及单克隆抗体疗法，但它们各自存在短板：有的存在显著的药物相互作用或肝酶升高风险，有的疗效有限或对骨骼软骨有不良影响，更棘手的是，病毒突变常常使抗体疗法失效。因此，医学界迫切需要开发一种广谱、安全且能有效应对病毒变异的抗病毒平台。此时，小干扰RNA（siRNA）疗法因其高特异性和强大的抗病毒活性而备受瞩目。然而，如何将siRNA精准、高效地递送到肝外靶器官（如呼吸道），并最大限度地减少其可能引发的非特异性免疫反应，是将其转化为实际临床应用的关键障碍。近期发表在《Drug Delivery and Translational Research》上的一项研究，为我们揭示了解决这些难题的一条有希望的路径。
本研究主要运用了几项关键技术方法。首先，研究人员构建了基于慢病毒的Calu-3细胞（人支气管上皮细胞）报告细胞系，该细胞系稳定表达了与绿色荧光蛋白（GFP）融合的SARS-CoV-2靶基因片段（膜蛋白、核衣壳蛋白和ORF1a/NSP1），用于高通量、直观地评估不同LNP-siRNA制剂的基因沉默效果。其次，研究采用微流控混合技术制备了三种分别模拟已上市药物配方的LNP（基于MC3、SM-102和ALC-0315离子化脂质），并系统表征了它们的粒径、多分散指数和siRNA封装效率。第三，利用流式细胞术长期监测（长达9天）了LNP的细胞摄取（通过罗丹明标记）和GFP沉默效率。第四，通过定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）在HeLa T4+和Calu-3细胞中系统评估了各种LNP-siRNA制剂对干扰素刺激基因（ISG）的诱导作用，以衡量其脱靶免疫激活风险。最后，研究在体内利用C57BL/6J小鼠模型，通过鼻内给药方式评估了优选LNP-siRNA制剂的安全性，监测了体重变化、支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞计数以及全面的肺功能参数。
结果
LNP-siRNA的制备及细胞进入特性探索
研究首先证明，使用罗丹明标记的、模拟首个FDA批准的siRNA疗法Onpattro?配方的MC3 LNP，能够成功将siRNA递送到293T报告细胞中。与使用脂质体转染试剂（Lipofectamine）转染的裸露siRNA相比，LNP封装延长了siRNA的细胞内作用时间，尽管达到相近沉默效果需要更高剂量（25 nM vs. 5 nM）。
LNP-siRNA制剂的表征与基因沉默效果
研究系统比较了三种LNP（MC3、SM-102、ALC-0315）封装四种先导siRNA（18, 25, 27, 30）的效果。所有制剂粒径均小于150 nm，多分散指数低，封装效率高于80%，符合肺部给药要求。在Calu-3报告细胞系中，三种LNP均能有效递送siRNA并导致靶基因表达沉默，效果呈剂量依赖性。其中，MC3 LNP在较低浓度（25 nM）下即显示出最强的基因沉默效果，且其细胞摄取在给药后能维持更长时间。
LNP-siRNA制剂的脱靶效应
脱靶免疫激活评估是关键安全指标。在HeLa T4+细胞中，MC3 LNP未诱导任何被测ISG（IFIT1, OAS1, ISG20, Viperin）表达。而SM-102 LNP在某些siRNA处理下诱导了ISG20和OAS1表达，ALC-0315 LNP仅在使用siRNA 30时诱导了ISG20。在更相关的呼吸道上皮模型Calu-3细胞中，MC3 LNP同样未诱导任何ISG（包括RIG-I）表达。相反，SM-102和ALC-0315 LNP均显著诱导了OAS1的表达。这一结果表明，基于MC3的LNP具有更优的免疫安全性。
LNP-siRNA在体外对SARS-CoV-2的保护作用
鉴于MC3 LNP最低的免疫原性，研究进一步评估了其抗病毒效力。在Vero E6细胞中，无论是感染前（BA.1变异株）还是感染后2小时（XBB.1.5变异株）给予MC3 LNP-siRNA 27和/或30处理，均能显著降低病毒核衣壳（NC）基因的RNA水平，其中siRNA 27和30联合使用效果最强。
LNP封装的Ome-AS456修饰siRNA的基因沉默、脱靶ISG和抗病毒效果评估
为降低免疫原性，研究对siRNA 30的反义链第4、5、6位进行了2′-O-甲基（2′-O-methyl）化学修饰（Ome-AS456）。结果显示，化学修饰能消除ALC-0315 LNP诱导OAS1表达的能力，且不损害其基因沉默和抗病毒活性。在Calu-3细胞中，修饰后的MC3 LNP-siRNA 30（MC3-30mod）在低浓度下（25 nM）的沉默效果优于同等浓度的ALC-0315制剂。在Vero E6细胞感染模型中，MC3-30mod在感染后2小时给药，从第5天到第7天均表现出显著的保护作用，且效果优于ALC-0315-30mod。此外，研究还探索了多种siRNA组合（如18+30, 27+30等）的鸡尾酒疗法，结果显示包含siRNA 30的组合能提供更强的抗病毒保护，这为应对病毒变异提供了策略。
MC3 LNP-siRNA在Vero E6和Calu-3细胞中感染后的治疗效力
研究进一步将治疗时间推迟至感染后24小时。在Vero E6细胞中，所有四种MC3 LNP-siRNA（18, 25, 27, 30mod）在100 nM浓度下仍能在感染后至少5天内提供保护。在更接近生理状态的Calu-3细胞中，感染后2小时给予25 nM MC3-30mod可提供长达7天的显著保护。即使在感染24小时后才进行治疗，MC3 LNP-siRNA 27和30mod在25 nM和100 nM浓度下仍能表现出最大的保护作用，而siRNA 18和25则效果不明显。这证明了MC3 LNP-siRNA 27和30mod具有作为暴露后预防性治疗的潜力。
体内单次和多次剂量LNP-siRNA的生物安全性评估
最后，研究在小鼠模型中评估了鼻内递送MC3 LNP-siRNA的安全性。单次给药（1 μg, 2.5 μg, 5 μg siRNA/只）后5天内，小鼠体重稳定。然而，5 μg剂量导致了支气管肺泡灌洗液中白细胞显著增加，表明存在局部炎症反应。在连续5天每日给予5 μg的重复给药实验中，小鼠体重依然稳定，但肺部炎症细胞浸润进一步增加。尽管如此，全面的肺功能测试（包括吸气容量、呼吸系统阻力、中央气道阻力、滞后面积、用力肺活量和总肺容量）显示，治疗组与对照组（PBS）无显著差异，表明重复给药并未引起可测量的肺功能损伤。
结论与讨论
本研究首次系统比较了三种基于临床获批平台的LNP（MC3、SM-102、ALC-0315）用于呼吸道递送抗SARS-CoV-2 siRNA的效果。核心结论是，基于MC3（Onpattro?配方）的LNP在呼吸道上皮细胞中表现出最优的综合性能：它具有高效的siRNA递送和基因沉默能力，同时引发的脱靶免疫反应（干扰素刺激基因表达）最小。相比之下，基于SM-102（Moderna疫苗配方）和ALC-0315（Pfizer疫苗配方）的LNP虽也能有效递送，但会不同程度地诱导免疫反应。对siRNA进行2′-O-甲基化学修饰可进一步降低这种免疫原性而不影响疗效。
更重要的是，该研究证明了MC3 LNP-siRNA在感染后24小时给药仍能在体外模型中有效抑制病毒，这为将其开发为暴露后预防或早期治疗药物提供了关键依据。体内安全性实验表明，治疗剂量的鼻内给药耐受性良好，不会影响体重或肺功能，尽管高剂量或重复给药会引起轻度的肺部白细胞浸润，这提示未来临床剂量需要优化以平衡疗效与局部刺激性。
这项研究的重大意义在于，它超越了以往多数仅关注siRNA序列本身或单一递送系统的研究，直接对已有人体安全数据背书的三种LNP平台进行了“头对头”比较。研究明确指出，不同LNP配方的内在免疫学特性差异显著，这对于旨在最小化炎症的呼吸道治疗性（而非疫苗）应用至关重要。研究结果表明，为静脉给药设计的MC3 LNP平台，其特性可能比为疫苗免疫设计的SM-102/ALC-0315平台更适合用于呼吸道的siRNA治疗。这为开发下一代广谱、抗突变、且安全的抗呼吸道病毒RNAi疗法奠定了坚实的实验基础，并指明了平台选择的优化方向。
