《Drug Delivery and Translational Research》：Fibroblast-derived small extracellular vesicles loaded with tacrolimus enhances dermal delivery and alleviates cytokine-overdriven skin inflammation
编辑推荐：
为解决他克莫司传统外用制剂皮肤渗透性差、疗效不佳、局部刺激强等问题，研究人员利用成纤维细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）作为新型递送载体（Tac-sEVs）。研究结果表明，该载药系统封装效率达79.19%，并能实现缓释和显著的深层透皮递送，有效抑制SARS-CoV-2刺突糖蛋白诱导的多种促炎细胞因子（如IFN-γ、GCS-F、IL-2、IL-4）过表达，为长新冠相关皮肤炎症等细胞因子驱动的皮肤病提供了安全且有前景的治疗平台。
近年来，新型冠状病毒感染（COVID-19）的长期影响——即“长新冠”（Long COVID），正逐渐显现为一个复杂的医学挑战。除了广为人知的疲劳、认知障碍等症状外，越来越多的临床观察发现，长新冠也与一系列慢性炎症性皮肤病的发生或恶化紧密相关。这背后，往往涉及一种被称为“细胞因子风暴”的免疫过度激活现象。具体来说，像IFN-γ、IL-4、IL-2、GCS-F（粒细胞集落刺激因子）等促炎细胞因子的过量产生，会驱动皮肤角质形成细胞过度活跃、免疫细胞持续浸润以及皮肤屏障功能紊乱，导致诸如银屑病（Psoriasis）、特应性皮炎（Atopic Dermatitis）以及荨麻疹等皮肤问题反复发作，迁延不愈，给患者带来极大的身心困扰。
要平息这些皮肤深处的“炎症风暴”，精准地将有效药物输送到病灶深处是治疗的关键。他克莫司（Tacrolimus）作为一种钙调神经磷酸酶抑制剂，能够有效抑制T细胞活化和多种细胞因子的产生，是治疗此类炎症性皮肤病的重要非激素类外用药。然而，传统的他克莫司软膏面临着巨大的递送困境。由于其分子量较大（约822.05 Da）且脂溶性强，药物难以有效穿透皮肤的角质层，大部分药物只能停留在皮肤表面，导致疗效不佳。为了达到治疗效果，往往需要提高剂量或增加用药频率，这又带来了局部灼热、刺激感等副作用，甚至存在潜在的全身吸收风险。尽管已有多种纳米载体（如脂质体、聚合物胶束）尝试改善这一状况，但它们在深层皮肤穿透、靶向性和稳定性方面仍存在局限。因此，开发一种能够精准、高效地将药物递送至皮肤炎症部位，同时实现持续、可控释放的新技术，成为皮肤药理学领域的迫切需求。
为了解决这一难题，研究人员将目光投向了一种极具潜力的天然“纳米快递员”——小细胞外囊泡（Small Extracellular Vesicles， sEVs）。sEVs是细胞自然分泌的纳米级（30–200 nm）膜泡，作为细胞间通讯的信使，具有良好的生物相容性、低免疫原性和天然的跨生物屏障能力。特别值得一提的是，来源细胞会赋予sEVs独特的“归巢”特性，使其更容易被同类或关联细胞识别和摄取。该研究创新性地选择了皮肤中的主要基质细胞——人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblast）作为sEVs的来源。与常用的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）来源的sEVs相比，成纤维细胞来源的sEVs理论上更贴近皮肤内环境，可能具有更好的皮肤组织靶向性和修复调节能力。发表于《Drug Delivery and Translational Research》的这项研究，首次探索了利用成纤维细胞来源的sEVs负载他克莫司（Tac-sEVs），并将其作为新型递送平台，用于治疗与长新冠相关的细胞因子过度驱动型皮肤炎症。
为了开展这项研究，作者团队主要采用了以下几个关键技术方法：首先，利用蔗糖垫密度超速离心法从人真皮成纤维细胞培养上清中分离纯化sEVs。其次，通过超声法将他克莫司高效地封装进sEVs，形成Tac-sEVs。再者，运用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和点印迹（Dot blot）等技术对sEVs及Tac-sEVs的形貌、粒径、浓度、标志物表达及载药效率进行表征。在药效学评价中，使用了猪耳皮肤进行离体经皮渗透和皮肤药代动力学（使用胶带剥离技术）研究，并与市售软膏和他克莫司溶液进行对比。最后，在细胞水平上，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测Tac-sEVs对SARS-CoV-2刺突糖蛋白诱导的细胞因子过表达的抑制能力，并通过CCK-8和Alamar Blue实验以及PKH-26荧光标记评估其细胞毒性、细胞存活率及细胞摄取效率。
研究结果
1. 小细胞外囊泡的分离与表征
通过透射电子显微镜（TEM）观察，成功分离的sEVs呈现出典型的杯口状球形结构，粒径约在90-190 nm之间，符合sEVs的标准尺寸范围。纳米颗粒跟踪分析（NTA）进一步确认了其粒径分布，负载他克莫司后形成的Tac-sEVs平均粒径略有变化。点印迹分析证实了sEVs表达其标志性蛋白CD63、TSG101和HSP70，而未检测到内质网污染物标志物GRP94和Calnexin，证明了分离物的纯度。Micro BCA蛋白定量测定了sEVs的蛋白浓度。
2. Tac-sEVs的制备与载药特性
采用超声法成功将他克莫司载入sEVs，制备了Tac-sEVs。其载药效率（Encapsulation Efficiency, EE%）高达79.19% ± 0.01%，表明该载药方法非常高效。TEM图像显示，负载药物后的Tac-sEVs仍保持完整的球形膜结构，内部可见电子致密区，提示药物被成功包裹。
3. 离体皮肤渗透与药代动力学研究
弗朗茨扩散池（Franz Diffusion Cell）实验显示，Tac-sEVs在最初的10小时内有一个快速的药物释放，随后转变为持续、可控的缓释模式。更重要的是，胶带剥离实验（Tape-Stripping）的皮肤药代动力学数据表明，Tac-sEVs在皮肤真皮层的药物浓度显著高于市售他克莫司软膏和游离的他克莫司溶液。这证实了sEVs作为递送载体能够显著增强他克莫司在深层皮肤组织（即炎症主要发生部位）的穿透和蓄积能力，为解决传统制剂渗透不足的难题提供了直接证据。
4. Tac-sEVs对细胞因子表达的抑制
为了评估其抗炎效果，研究人员用SARS-CoV-2刺突糖蛋白（S1）刺激人真皮成纤维细胞以模拟病毒诱导的皮肤炎症模型。ELISA检测结果显示，刺突糖蛋白显著诱导了IFN-γ、GCS-F、IL-2和IL-4等多种促炎细胞因子的过表达。然而，无论是游离的他克莫司还是Tac-sEVs，均能有效下调这些细胞因子的表达，显示出强大的免疫抑制作用。这表明Tac-sEVs在递送药物的同时，保留了药物本身的药理活性，能够有效干预长新冠相关皮肤炎症的核心病理环节——细胞因子风暴。
5. 细胞活性、增殖与摄取研究
细胞毒性实验（Alamar Blue和CCK-8实验）证实，Tac-sEVs与游离他克莫司均表现出很高的细胞相容性，细胞活力和增殖率均在90%以上，且Tac-sEVs组的细胞存活率甚至更高（133.44%）。这排除了载药系统本身可能带来的毒性担忧。此外，利用PKH-26红色荧光染料标记sEVs进行的细胞摄取实验显示，成纤维细胞能够高效内化这些囊泡，证实了Tac-sEVs具有良好的细胞递送能力，为其在体内的作用机制提供了支持。
结论与展望
本研究成功构建并系统评价了一种基于成纤维细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）的新型他克莫司递送系统——Tac-sEVs。该平台凭借其纳米尺寸、天然来源的膜结构以及成纤维细胞自身的生物学特性，成功克服了传统他克莫司软膏的关键缺陷。研究核心结论可以概括为以下几点：
- 1.
高效封装与良好表征：通过超声法可实现对他克莫司的高效装载（EE%约79%），且负载后的Tac-sEVs保持了完整的囊泡结构和sEVs标志物特征。
- 2.
卓越的皮肤递送性能：离体皮肤实验证明，Tac-sEVs能显著促进他克莫司向皮肤真皮层的渗透和蓄积，其递送效率远超市售软膏，并展现出理想的缓释特性。
- 3.
强大的抗炎活性：在细胞炎症模型中，Tac-sEVs与游离药物一样，能有效抑制SARS-CoV-2刺突糖蛋白诱导的多种关键促炎细胞因子（如IFN-γ、IL-4）的过度表达，证实了其递送过程不损害药物活性。
- 4.
优异的生物安全性：细胞实验表明Tac-sEVs具有很高的生物相容性，并能被皮肤细胞有效摄取，为体内应用的安全性提供了初步保障。
这项研究的重大意义在于，它开创性地将皮肤原位细胞（成纤维细胞）来源的sEVs与经典免疫抑制剂他克莫司相结合，为解决外用药物经皮递送效率低下的“老大难”问题提供了一个极具潜力的新策略。特别是，该研究将其应用场景明确指向了当前备受关注的长新冠（Long COVID）相关皮肤炎症，为应对这一新兴临床挑战提供了新的治疗思路和技术平台。Tac-sEVs不仅有望提高他克莫司在治疗特应性皮炎、银屑病等传统炎症性皮肤病的疗效并减少副作用，更可能为其他需要皮肤局部靶向递送药物的领域（如皮肤癌、瘢痕治疗等）带来启发。当然，从实验室成果到临床转化，仍需进一步开展动物体内药效、长期毒理学及大规模生产工艺等研究。但毋庸置疑，这项研究为下一代智能、高效、安全的经皮药物递送系统的开发点亮了新的方向。
