动作电位与钙释放的协同效应：揭示亨廷顿病模型小鼠骨骼肌力量的分子平衡机制

《PFLUGERS ARCHIV-EUROPEAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY》：Integrated effects of altered action potentials and calcium release on skeletal muscle force generation in transgenic Huntington’s disease mice

为阐明为何单独的离子通道或钙释放缺陷无法充分解释亨廷顿病（HD）模型骨骼肌的收缩功能，研究人员通过同时记录动作电位（AP）和肌浆网Ca2+释放，定量分析其协同作用与力量产生的关系。研究发现，由于AP时程延长和钙结合蛋白表达改变，降低了肌浆网Ca2+释放通量的峰值，但并不导致预期的力量减弱。这一整合机制揭示了HD肌肉在单次收缩中维持看似正常力量的脆弱平衡，并解释了其对强直收缩的抗性。该多分子研究途径为理解HD及其他疾病状态下的组织功能提供了新视角。

　　

亨廷顿病（HD）通常被认为是一种以运动障碍和神经退行为主要特征的疾病。然而，随着研究的深入，科学家们发现，由突变型亨廷顿蛋白基因广泛表达引起的功能障碍，并不仅限于大脑，而是广泛存在于包括骨骼肌在内的多种外周组织中。在HD患者的肌肉中，常常观察到力量下降和运动能力受损。那么，这些肌肉功能障碍背后的细胞机制究竟是什么？传统研究分别指向了两条关键通路：一是由于氯离子（Cl^–）和钾离子（K⁺）通道功能障碍导致的细胞膜过度兴奋性和动作电位时程延长；二是由于兰尼碱受体（Ryanodine receptor）功能障碍导致的肌浆网（Sarcoplasmic Reticulum， SR）钙离子（Ca²⁺）释放减少。奇怪的是，单独来看，前者通常会导致肌肉持续收缩（肌强直），而后者则直接导致肌肉无力。但在HD模型小鼠（如R6/2模型）中，两者并存却并未导致预期的肌强直或单次收缩力量的显著下降。这种矛盾现象提示，可能存在一种更复杂的、多分子协同作用的机制在维持着肌肉功能的微妙平衡。为了解开这个谜团，一支研究团队在《PFLUGERS ARCHIV-EUROPEAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY》上发表了一项开创性研究，通过整合性方法，同时测量了HD模型肌肉中动作电位和SR Ca²⁺释放的动态过程，并将其与肌肉力量的产生进行了定量关联。

为了深入探究HD骨骼肌功能异常的整合机制，研究人员主要采用了电生理学、钙成像、蛋白质分析和肌肉力量测量等多学科交叉技术。他们以R6/2转基因HD模型小鼠和野生型对照小鼠为研究对象，分离了后肢的趾短屈肌和骨间肌纤维。核心实验包括：使用细胞内微电极技术同时记录动作电位和利用钙指示剂Fluo-4监测肌浆网Ca²⁺释放；在电压钳模式下，使用特定的AP波形作为指令信号，以分离AP波形与内在细胞特性的影响；使用四乙基铵（TEA）阻断钾通道，人为延长AP，研究AP时程对Ca²⁺释放的影响；通过蛋白质印迹和转录组学分析关键钙调控蛋白（如SERCA、肌钙蛋白C、小清蛋白）的表达变化；最后，在离体伸趾长肌上测量等长收缩力量，评估单次收缩和重复刺激下的肌肉功能。

AP诱发的Ca²⁺释放

研究首先在电流钳模式下同时记录R6/2和对照小鼠肌肉纤维的动作电位和Ca²⁺瞬变。与先前报道一致，R6/2肌肉的动作电位时程显著延长（D40和D80衰减时间增加），且峰值和最大上升速率降低。关键的发现是，虽然R6/2肌纤维的SR Ca²⁺释放通量峰值显著低于对照，但Ca²⁺释放事件的持续时间（以半峰全宽FWHM衡量）却显著增加。这使得可用于收缩的“游离Ca²⁺”总量在两组间无显著差异，表明延长的Ca²⁺释放时程部分补偿了释放峰值的降低。

阻断K⁺通道可增加Ca²⁺释放时程

为了验证AP时程延长是否是导致Ca²⁺释放时程增加的原因，研究者在野生型肌肉中应用了钾通道阻断剂TEA，以人工延长动作电位。结果发现，随着TEA浓度的增加，AP的复极化时程（D40， D80）相应延长，同时Ca²⁺释放通量的持续时间和可用于收缩的Ca²⁺总量也随之增加。这直接证明了AP波形的延长可以导致SR Ca²⁺释放时间的延长。

通过电压钳分析Ca²⁺释放改变的机制

为了精确区分AP波形和肌纤维内在特性（即基因型）各自的影响，研究者在电压钳模式下，将平均的对照或R6/2 AP波形作为指令电压，分别施加到对照和R6/2肌纤维上。结果显示，SR Ca²⁺释放通量的峰值主要受基因型影响（R6/2显著低于对照），而与施加的AP波形无关。相反，Ca²⁺释放的持续时间（FWHM）则强烈依赖于AP波形，基因型的影响较小。最重要的是，当R6/2肌纤维受到其自身的、时程延长的AP波形刺激时，尽管峰值释放通量低，但由于释放时间延长，其可用于收缩的Ca²⁺总量与对照肌纤维受到自身AP刺激时无显著差异。这明确揭示了R6/2肌肉中延长的AP波形通过延长SR Ca²⁺释放时程，补偿了因兰尼碱受体功能障碍导致的峰值释放不足。

Ca²⁺结合蛋白的表达

除了电信号和钙释放的协同变化，研究者还检查了关键钙调控蛋白的表达水平。在R6/2小鼠的趾短屈肌/骨间肌中，负责将胞质钙泵回肌浆网的SERCA1和作为慢钙缓冲蛋白的小清蛋白（Parvalbumin）的表达量均显著下降，而快肌钙蛋白C（Troponin C）的表达量则保持不变。这种蛋白表达谱的改变（SERCA和小清蛋白减少）预计会增加肌浆中可用于与肌钙蛋白C结合的游离Ca²⁺浓度，从而进一步增强收缩力。研究者建立了一个基于平衡的数学模型，考虑了钙与这些关键蛋白（SERCA、小清蛋白、肌钙蛋白C）的可逆结合，结果预测R6/2肌纤维中与肌钙蛋白C结合的Ca²⁺量与对照相似，这与力量测量结果一致。

等长力量测量

最后，研究测量了伸趾长肌的等长收缩力量。结果显示，在单次收缩中，R6/2肌肉的比力（单位质量的力量）与对照组相比并无显著差异，这与前述的电生理和钙信号整合机制相符。然而，这种脆弱的平衡在轻度重复刺激下（例如0.3 Hz的10次刺激）开始瓦解，R6/2肌肉出现了比对照组更明显的收缩力下降和舒张时间延长，表明其兴奋-收缩耦联在应对重复活动时存在缺陷。

本研究揭示了一个精妙而脆弱的分子整合机制，解释了亨廷顿病模型小鼠骨骼肌功能异常的复杂表现。R6/2肌肉中，由于K⁺和Cl^–通道功能障碍导致的动作电位时程延长，并非一个单纯的病理缺陷，而是扮演了一个关键的补偿角色。它通过延长肌浆网Ca²⁺释放的持续时间，部分抵消了因兰尼碱受体功能受损而降低的钙释放峰值。与此同时，钙结合蛋白（如SERCA1和小清蛋白）表达的减少，进一步调整了肌浆内的钙动力学，使得最终可用于驱动收缩的钙离子总量得以维持在接近正常水平。这种多分子水平的“协同适应”或“病理性代偿”，解释了为什么单独的离子通道缺陷（通常导致肌强直）或单独的钙释放缺陷（通常导致无力）均不能预测HD肌肉的功能，也说明了为何R6/2肌肉在单次收缩时表现出令人惊讶的正常力量，同时对肌强直表现出抵抗性。

这项研究的意义深远。它首次在HD模型中将动作电位异常、钙释放缺陷以及钙调控蛋白表达改变置于一个统一的框架下进行量化分析，清晰地展示了这些看似独立的病理变化是如何相互作用、共同决定了组织水平的功能输出。这一整合性视角不仅深化了我们对HD骨骼肌病理生理学的理解，更重要的是，它揭示了一个脆弱的平衡状态。该平衡在单次刺激下尚可维持，但在轻度重复活动下即迅速崩溃，这可能与HD患者运动耐量下降和易疲劳的临床表现直接相关。该研究建立的多分子研究范式也为探究其他正常或疾病状态下更复杂的通路整合，尤其是在重复活动期间的通路交互作用，奠定了重要的方法学基础。