《Scientific Reports》：Development and evaluation of recombinant dense granule 14 for serological diagnosis of Toxoplasma gondii infection in domestic cats
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本研究旨在解决猫作为弓形虫终宿主，其血清学诊断工具需提升敏感性与特异性的问题。研究人员开发并评价了以重组弓形虫致密颗粒14蛋白(TgGRA14)为包被抗原的间接ELISA(iELISA)。结果显示，该方法检测猫血清样本的灵敏度达95.9%，特异性为90.0%，与间接荧光抗体试验(IFAT)一致性良好(kappa=0.824)。此iELISA是一种高效、准确的诊断工具，对弓形虫病的流行病学监测和防控具有重要应用价值。
弓形虫，这种微小的单细胞寄生虫，与我们的生活比想象中更为“亲近”。它不仅感染包括人类在内的几乎所有温血动物，更是全球范围内重要的公共卫生问题。家猫，作为这种寄生虫在自然界中唯一能排出具有传染性卵囊的终宿主，在弓形虫的生命循环和传播中扮演着至关重要的角色。无论是流浪猫还是家养宠物猫，其感染状况都直接影响着环境中弓形虫卵囊的污染水平，进而关系到人类和其他动物的感染风险。因此，准确、高效地监测猫的弓形虫感染状况，是评估传播风险、制定有效防控策略的第一道防线。然而，现有的血清学诊断方法，如经典的间接荧光抗体试验(IFAT)，虽然可靠，但在面对大规模样本筛查时，往往在操作的便捷性、标准化程度以及成本效益上存在挑战。研究者们一直在寻找一种性能更优、更适合流行病学现场应用的诊断工具。于是，一项聚焦于弓形虫关键致密颗粒蛋白的研究应运而生，旨在为猫的弓形虫血清学诊断提供一个新的利器。
这项发表于《Scientific Reports》的研究，核心目标是开发并评价一种基于重组弓形虫致密颗粒14蛋白（TgGRA14）的间接酶联免疫吸附试验（iELISA），用于家猫弓形虫感染的血清学诊断。为了达成目标，研究团队运用了多项关键技术。首先，他们进行了分子克隆与蛋白表达，合成TgGRA14基因片段，将其克隆至pET-28a载体，并转化入大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的表达与纯化。其次，他们通过蛋白质印迹和质谱分析对纯化蛋白的抗原性及身份进行了验证。最后，研究建立了基于重组TgGRA14的iELISA方法，并利用149份猫血清样本，以IFAT作为参考标准，对新方法的诊断性能（包括灵敏度、特异性、一致性等）进行了系统评估和比较。
重组TgGRA14蛋白的表达、纯化与鉴定
研究人员成功表达了带有N端FLAG标签的重组TgGRA14蛋白，并通过抗FLAG亲和层析进行了纯化。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示，该重组蛋白的分子量约为29 kDa，与预期大小相符。蛋白质印迹和质谱分析进一步证实了该蛋白具有良好的抗原性，且与弓形虫TgGRA14蛋白的序列一致性高达99.6-100%。这些结果表明，所获得的重组蛋白纯度较高、身份明确，适合用作诊断抗原。
基于TgGRA14的iELISA与IFAT检测结果的比较
将纯化的重组TgGRA14蛋白作为包被抗原，建立iELISA方法，并对149份猫血清样本进行检测。同时，使用间接荧光抗体试验(IFAT)作为参考方法进行平行检测。结果显示，iELISA检测出的弓形虫抗体阳性率为38.3%，而IFAT的阳性率为32.9%。两种方法在检测结果上表现出高度的一致性。
基于TgGRA14的iELISA的诊断性能评估
以IFAT结果为“金标准”，研究人员对基于TgGRA14的iELISA的诊断性能进行了全面评估。计算显示，该iELISA方法的灵敏度（即正确识别阳性样本的能力）高达95.9%，特异性（即正确识别阴性样本的能力）为90.0%。两种方法检测结果的一致性强度通过Kappa系数进行评估，得到的Kappa值为0.824，表明两者具有高度一致性。这些数据证明，基于重组TgGRA14的iELISA在诊断猫弓形虫感染方面具有优异的检测能力。
讨论与结论
本研究成功开发并系统评价了一种基于重组弓形虫致密颗粒14蛋白（TgGRA14）的新型间接ELISA（iELISA），用于家猫弓形虫感染的血清学诊断。该方法的诊断性能卓越，灵敏度（95.9%）和特异性（90.0%）均处于高水平，且与传统的间接荧光抗体试验（IFAT）具有高度一致性（Kappa=0.824）。相较于IFAT，iELISA在操作上更具标准化、通量化优势，更适用于大规模的血清学筛查和流行病学监测。研究结果表明，重组TgGRA14蛋白是一种优秀的诊断抗原，以其为基础的iELISA为猫弓形虫感染的准确、高效诊断提供了一个强有力的新工具。这项工作的意义不仅在于提升了诊断技术本身，更重要的是，它为有效监测和控制作为弓形虫关键终宿主的猫群感染状况提供了切实可行的解决方案，对于从源头降低弓形虫病的传播风险、保障公共卫生安全具有重要的应用价值和推广前景。
