《Nature Communications》：Allosteric and energetic remodeling of a PDZ domain by protein domain extensions
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本研究为阐明蛋白结构域延伸对蛋白调控机制与进化潜力带来的具体影响，研究人员针对一个PDZ结构域模型，量化了两种不同延伸对其功能调控的能量图谱重塑效应。通过分析超过19万个蛋白变体的丰度与配体结合数据，测量了PDZ结构域内突变及突变与延伸之间约7000个能量耦合的自由能变化。结果表明，无论是结构性延伸还是动态性延伸，均能显著且特异性地重塑其能量景观，包括改变超过400个突变的折叠稳定性或结合能，以及影响超过300个变构突变位点，其中包含溶剂可及表面位点。这项研究揭示了延伸或修剪结构域可以重新构建其能量与变构图谱，从而增加或减少对蛋白功能进行变构控制的机会，为理解蛋白功能调控与进化提供了新视角。
蛋白质是生命活动的核心执行者，其众多复杂功能通常由被称为“结构域”的独立折叠单元来完成。这些结构域在不同蛋白质中具有结构保守性，但并非完全一致。一个有趣且关键的问题是：连接在核心结构域之外的那些“额外部分”——即结构域延伸——究竟会对核心结构域的功能产生怎样的影响？这不仅是理解蛋白质如何被精确调控的核心，也关乎蛋白质在进化长河中如何获得新功能的潜力。然而，以往的研究大多聚焦于孤立结构域本身，对于这些延伸部分如何从能量和变构层面重塑核心结构域的功能图谱，我们仍知之甚少。
为了解决这一根本问题，一项发表于《Nature Communications》的研究应运而生。研究人员选择了一个经典的蛋白质相互作用模块——PDZ结构域作为模型，开展了一项规模宏大的定量分析。他们的核心目标是：精确量化两种不同类型的结构域延伸对一个PDZ结构域能量景观的改造作用，从而揭示延伸如何影响结构域的稳定性、配体结合能力以及内部的变构通讯网络。
为了达成这一目标，研究团队运用了几项关键的技术方法。首先，他们构建了一个包含超过19万个PDZ结构域变体（包含单点突变及与延伸组合）的深度突变扫描文库。其次，利用深度测序技术，平行定量测定了所有变体在细胞内的蛋白质丰度（用以反映折叠稳定性）以及与荧光标记配体的结合活性。最后，通过对这些海量数据进行生物信息学分析和能量计算，绘制出了突变与结构域延伸之间精细的能量耦合图谱。这项研究并未涉及特定的临床样本队列，其模型体系来源于经典的工程化PDZ结构域。
Both a structured extension and a more dynamic extension substantially but specifically re-shape the energy landscape.
为了探究结构域延伸的影响，研究人员设计了两种延伸：一种是与PDZ结构域共折叠的、结构明确的α-螺旋（结构性延伸）；另一种是柔性更强的、动态性较高的延伸序列（动态性延伸）。通过系统性地测量携带这些延伸的PDZ结构域变体的折叠自由能和配体结合自由能，他们发现，无论是结构性延伸还是动态性延伸，都并非简单地产生全局性、非特异性的效应。相反，它们以一种“精确制导”的方式，特异性地重塑了整个PDZ结构域的能量图谱。这意味着，延伸的存在改变了核心结构域内无数可能突变对其稳定性和功能的影响模式。
Deleting an α-helix alters the energetic consequences of >400 mutations in >50 sites on fold stability or binding energy.
研究人员进一步聚焦于结构性延伸（即α-螺旋）的具体作用。当他们“修剪”掉这个α-螺旋延伸后，发现其影响深远而具体：PDZ结构域内部超过50个位点上的400多种突变，其对于蛋白质折叠稳定性或配体结合能的能量效应（即ΔΔG值）发生了显著改变。这强烈表明，一个看似附属的结构性延伸，能够广泛地重新布线（rewire）核心结构域的能量响应网络，从根本上改变其对于遗传突变（可能对应自然进化中的氨基酸替换）的耐受性或敏感性。
The effects of >300 allosteric mutations, including at solvent-accessible surface sites.
更引人注目的是对变构效应的影响。变构是指发生在蛋白质一位点（变构位点）的扰动（如突变、配体结合）能够远程影响另一位点（功能位点，如配体结合口袋）活性的现象。研究发现，删除α-螺旋延伸后，有超过300个突变位点的变构效应发生了改变。这些位点不仅包括蛋白质内部的残基，甚至包含了位于溶剂可及表面的位点。这表明，结构域延伸能够深刻地影响蛋白质内部以及表面的变构通讯路径，从而增加或移除通过远端位点调控核心功能的潜在可能性。
研究通过大规模定量分析揭示，蛋白质的结构域延伸是重塑其能量与变构景观的关键 architectural element（结构要素）。具体而言，无论是刚性的结构性延伸（如α-螺旋）还是柔性的动态延伸，都能特异性地、大规模地改变核心PDZ结构域的能量图谱。这表现为：1） 显著改变数百个突变对蛋白质折叠稳定性和配体结合能的贡献；2） 重编超过300个位点的变构效应网络，影响范围延伸至蛋白质表面。这些发现表明，在蛋白质进化过程中，通过获得或失去结构域延伸，可以有效地“重新布线”其内部的能量耦合与变构路径，从而为产生新的调控机制或适应新的功能需求提供了一种高效的进化策略。这项研究将蛋白质结构域的延伸从单纯的“连接件”提升到了“功能景观设计师”的高度，为从能量和变构角度理解蛋白质复合物的功能调控、合理设计具有新特性的蛋白质药物或生物传感器提供了重要的理论框架和设计原则。
