《Nature Communications》：Engineered Un1Cas12f1 for multiplex genome editing with enhanced activity and targeting scope
编辑推荐：
紧凑型CRISPR-Cas12f系统是AAV递送基因治疗的潜力平台，但其应用受限于严格的PAM识别序列(如TTTR)和欠佳的编辑效率。本研究通过细菌文库筛选和哺乳动物细胞验证，开发了优化变体evoCas12f。它通过五个关键突变，将PAM识别范围扩展至NTNR/NYTR，使人类基因组中相邻PAM位点的中位距离缩短至2个核苷酸，并在TTTR位点的活性比野生型Un1Cas12f1提高了1.4倍，编辑效率高达91%。该系统还能在F0代小鼠中高效产生纯合突变，并成功应用于稳健的转录激活和精确的碱基编辑。
基因编辑技术CRISPR-Cas系统已彻底改变了生命科学研究与生物医药领域。其中，源自微生物的Cas12家族蛋白因相对紧凑的尺寸而备受关注，尤其是CRISPR-Cas12f亚型（也称为Cas14），其大小仅为传统Cas9蛋白的一半左右。这种“小身材”使其成为腺相关病毒（AAV）递送基因治疗的理想候选工具，因为AAV载体的包装容量有限。然而，光有“身材”优势还不够，一把好用的“基因剪刀”还需要精准、高效且能到达尽可能多的目标位点。当前，野生型的Cas12f系统，例如Un1Cas12f1，在实际应用中面临两大核心瓶颈：其一，其识别的原间隔序列毗邻基序（PAM）高度保守且严格（如TTTR），这大大限制了其在复杂基因组中的可靶向范围；其二，其编辑效率在哺乳动物细胞中往往不尽如人意。为了解决这些关键问题，研究人员开展了一项旨在“重铸利刃”的研究。
为了回答这些问题，研究人员主要运用了定向进化结合功能筛选的策略。首先，通过构建突变文库并在细菌中进行高通量筛选，以扩展PAM识别范围并提升活性。随后，在哺乳动物细胞系中验证筛选出的突变体变体的编辑效率、PAM兼容性和特异性。最后，在小鼠胚胎中进行体内功能验证，评估其产生遗传修饰的能力，并将优化后的系统应用于转录激活和碱基编辑等衍生工具的开发。
结果
1. 工程化改造生成高活性、宽PAM的evoCas12f变体
研究人员通过对Un1Cas12f1进行定向进化，筛选出了一个包含五个关键突变的优化变体，命名为evoCas12f。该变体显著扩展了PAM识别范围，从原本严格的TTTR（其中R代表A或G）放宽至更宽松的NTNR（其中N代表任意核苷酸）和NYTR（其中Y代表C或T）。这一改进极大地增加了其在基因组中的潜在靶点密度。定量分析表明，在人类基因组中，相邻可用的evoCas12f PAM位点之间的中位距离缩短至仅2个核苷酸，远优于野生型。同时，即便在原有的TTTR位点上，evoCas12f的编辑活性也比野生型Un1Cas12f1平均提高了1.4倍，在测试的位点中最高编辑效率达到了91%。
2. evoCas12f在小鼠体内实现高效基因编辑
研究进一步在活体动物水平验证了evoCas12f的功效。通过将evoCas12f系统显微注射到小鼠受精卵中，研究人员成功在F0代（即经编辑后出生的第一代）小鼠中实现了高效的基因编辑。值得注意的是，编辑不仅发生在具有典型TTTR PAM的位点，在非典型PAM位点（即NTNR/NYTR范围内的新位点）也观察到了显著的编辑活性，并成功获得了纯合突变的小鼠个体。这直接证明了工程化变体在扩展靶向范围的同时，保持了强大的体内编辑能力。
3. evoCas12f适用于转录激活和碱基编辑
为了展示evoCas12f平台的多功能性，研究人员将其与不同的效应结构域融合，构建了衍生工具。首先，将evoCas12f与转录激活因子VPR融合，实现了稳健的基因转录激活。其次，将evoCas12f与脱氨酶融合，开发了基于evoCas12f的碱基编辑器。该碱基编辑器表现出明确的编辑窗口，能够在特定位点实现精确的碱基转换（如C-to-T），为纠正点突变提供了新的紧凑型工具选项。
结论与讨论
本研究的核心成果是成功开发了evoCas12f，一个经过工程化改造的CRISPR-Cas12f变体。它通过引入五个关键突变，一举突破了野生型系统在PAM识别范围和编辑效率上的双重限制。evoCas12f将PAM识别谱扩展至NTNR/NYTR，极大提升了其在基因组中的靶向灵活性；其增强的编辑活性，特别是在哺乳动物细胞和小鼠模型中的高效表现，证明了其作为实用化基因组编辑工具的潜力。
这项研究的重要意义在于，它将CRISPR-Cas12f从一个概念上“小巧”但应用受限的系统，转变为一个真正“小巧而强大”的多功能平台。evoCas12f的紧凑尺寸（约400-700个氨基酸）使其非常适合装载于AAV载体中，用于体内基因治疗。其扩展的PAM范围使得针对更多疾病相关基因位点成为可能，而高效的编辑能力则直接关系到治疗效果。此外，研究还展示了其在转录调控和碱基编辑等精准应用中的适用性，进一步拓宽了其应用场景。
总之，evoCas12f代表了对紧凑型CRISPR工具箱的一次重要升级。它为实现高分辨率、多重化的基因组靶向操作提供了新工具，特别是在需要病毒载体递送的治疗性基因组工程领域，如遗传病治疗、癌症免疫疗法等，具有广阔的应用前景。这项研究为开发下一代高效、安全的基因治疗手段奠定了坚实的技术基础。相关成果发表在《Nature Communications》期刊上。
