《Nature Communications》：Multi-lineage hepatic organoids reveal toxic exosome mediated indirect hepatotoxicity
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本研究为解决药物开发中因评价工具有限和机制不明导致的间接肝毒性难题，研究人员构建了源自人胚胎干细胞、包含五种肝细胞类型的三维多谱系肝脏类器官模型。通过对58种肝毒性药物的筛选，鉴定出丙咪嗪可诱发间接肝毒性，其机制涉及肝星状细胞（HSC）酪氨酸激酶受体B（TrkB）激活，驱动外泌体中miR-34a-3p选择性富集形成“毒性外泌体”，进而靶向破坏肝细胞稳态。该研究为精准药物测试提供了仿生平台，并凸显了细胞间通讯在药物性肝损伤中的核心作用。
在药物研发的漫长征途中，肝脏毒性始终是横亘在科学家面前的巨大挑战，许多极具潜力的候选药物因此折戟沉沙。尤其棘手的是“间接肝毒性”——即药物并非直接攻击肝细胞，而是通过影响肝脏内的其他细胞，再“借刀杀人”般地损害肝实质。传统的二维细胞培养模型难以模拟复杂的人体肝脏微环境，而动物实验又与人体存在物种差异，导致间接肝毒性的评估手段匮乏，其背后的分子机制更如雾里看花，不甚明了。这严重阻碍了药物安全性的精准预测与评价。
为了攻克这一难题，一项发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上的研究应运而生。研究人员独辟蹊径，将目光投向了前沿的类器官技术。他们成功地从人类胚胎干细胞（hESC）中，构建出了一种包含五种关键肝脏细胞类型（包括肝细胞、肝星状细胞、内皮细胞等）的三维（3D）多谱系肝脏类器官。这个高度仿生的“迷你肝脏”为在体外重现人体肝脏复杂的细胞互作提供了前所未有的平台。
研究人员利用这一精密的“体外肝脏”，对58种已知具有肝毒性的药物进行了一次大规模的“安全筛查”。结果，抗抑郁药丙咪嗪（imipramine）脱颖而出，它被鉴定为一种能够诱发间接肝毒性的药物。进一步的机制探索揭示了一个精巧而致命的细胞间“通信”链条：丙咪嗪特异性地作用于肝脏非实质细胞——肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell， HSC）表面表达的酪氨酸激酶受体B（TrkB）。这一结合如同扣动了扳机，激活了细胞内的p53/hnRNPA2B1/DGCR8信号通路。
这条被激活的通路，驱动了一个关键变化：微小RNA（microRNA）miR-34a-3p在肝星状细胞来源的外泌体（exosome）中被选择性富集。这些装载了过量miR-34a-3p的外泌体，性质发生了转变，从普通的细胞间信使变成了“毒性外泌体”。它们像特洛伊木马一样，被释放到细胞外环境中，并被邻近的肝细胞摄取。
当毒性外泌体进入肝细胞后，其携带的miR-34a-3p便开始执行“破坏任务”。它通过下调肝细胞内一种至关重要的抗凋亡蛋白——X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达，从根本上瓦解了细胞的生存防线。XIAP的缺失，导致了凋亡执行者caspase3的激活，最终将肝细胞推向程序性死亡的深渊。整个过程清晰表明，丙咪嗪对肝细胞本身并无直接毒性，其伤害完全是通过肝星状细胞介导的毒性外泌体传递实现的。
为了在活体验证这一体外发现的机制，研究团队进行了动物实验。他们对小鼠进行了丙咪嗪的长期灌胃给药。实验结果与体外模型高度一致：在体内，丙咪嗪同样触发了肝星状细胞的凋亡，并通过毒性外泌体介导的方式，导致了肝细胞的损伤，而并未观察到对肝细胞的直接毒性作用。这有力地证实了该机制在生物体内的真实性与重要性。
本研究主要运用了以下几个关键技术方法：首先，利用人类胚胎干细胞定向分化和3D培养技术，构建了包含多种肝细胞类型的多谱系肝脏类器官。其次，采用高通量药物筛选平台对58种药物进行测试。再者，运用分子生物学手段（如Western blot、qPCR）和细胞功能学实验验证信号通路与凋亡。最后，通过分离和鉴定外泌体（如超速离心、纳米颗粒追踪分析、微小RNA测序）以及建立动物模型进行体内验证。
研究结果
构建多谱系肝脏类器官用于药物筛选
研究人员成功建立了源自hESC的3D多谱系肝脏类器官，该模型包含肝细胞、肝星状细胞、内皮细胞等五种细胞类型，高度模拟了体内肝脏结构。利用此平台对58种肝毒药物进行筛选，发现丙咪嗪在未引起直接肝细胞毒性的浓度下，能诱导类器官发生肝细胞损伤，从而将其鉴定为间接肝毒物。
丙咪嗪通过激活肝星状细胞TrkB受体触发毒性
机制研究表明，丙咪嗪特异性结合并激活肝星状细胞（而非肝细胞）表面的TrkB受体。基因敲低TrkB可完全阻断丙咪嗪诱导的肝细胞凋亡，证实TrkB是丙咪嗪引发间接肝毒性的关键起始靶点。
TrkB激活驱动p53/hnRNPA2B1/DGCR8通路及外泌体miR-34a-3p富集
丙咪嗪激活TrkB后，上调了肝星状细胞中肿瘤抑制蛋白p53的表达。p53进而与RNA结合蛋白hnRNPA2B1及微处理器复合物关键组分DGCR8相互作用，共同促进特定微小RNA前体的加工与装载。其中，miR-34a-3p被选择性富集到肝星状细胞分泌的外泌体中，形成“毒性外泌体”。
毒性外泌体将miR-34a-3p递送至肝细胞并诱导凋亡
从丙咪嗪处理的肝星状细胞中分离的外泌体，可直接导致肝细胞凋亡。这些外泌体中高水平的miR-34a-3p被转运至肝细胞后，通过靶向结合并抑制XIAP蛋白的mRNA，导致XIAP蛋白水平下降。XIAP的下调消除了其对caspase3活化的抑制，从而激活凋亡级联反应，引发肝细胞死亡。
体内实验验证毒性外泌体介导的肝损伤机制
对小鼠进行长期丙咪嗪灌胃后，观察到肝脏中肝星状细胞发生凋亡，并检测到血浆中外泌体miR-34a-3p水平升高。同时，小鼠肝脏出现明显的肝细胞损伤标志，但丙咪嗪对分离的原代肝细胞无直接毒性。该结果在生物体内完整复现了“药物→肝星状细胞→毒性外泌体→肝细胞损伤”的间接毒性通路。
结论与讨论
该研究取得了多项重要结论。首先，它成功构建了一个高度仿生的人源多谱系肝脏类器官模型，并将其确立为一个用于识别和研究间接肝毒性的强大平台。其次，研究以前所未有的清晰度，完整阐明了抗抑郁药丙咪嗪引发间接肝毒性的全新分子机制：从激活肝星状细胞TrkB受体开始，到触发p53/hnRNPA2B1/DGCR8通路，导致外泌体miR-34a-3p特异性富集，最终通过递送该miRNA至肝细胞、下调XIAP、激活caspase3而诱导肝细胞凋亡。第三，研究在动物体内证实了这一外泌体介导的间接肝毒性路径的真实存在。
这项工作的意义重大而深远。在理论层面，它首次系统揭示了外泌体作为细胞间“毒性信使”在药物性肝损伤（DILI）中的核心作用，为理解DILI，尤其是间接肝毒性的发病机制开辟了全新视角。在应用层面，所建立的多谱系肝脏类器官模型为药物研发提供了革命性的精准测试工具，有望在临床前阶段更早、更准确地预测药物的肝毒性风险，从而降低药物研发失败率、保障患者用药安全。此外，该研究发现的TrkB/p53/miR-34a-3p/XIAP这一信号轴，也为干预和预防特定药物（如丙咪嗪）引起的肝损伤提供了潜在的干预靶点。总之，该研究通过融合前沿的类器官技术与深入的机制探索，为解决药物肝毒性这一长期困扰医药界的难题提供了创新的解决方案和深刻的理论洞见。
