《Nature Communications》：HIF sustain a transcriptional regulatory circuit of EPAS1 expression in renal clear cell carcinoma
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在肾透明细胞癌中，肿瘤的发生与进展与缺氧诱导转录因子（HIF）的异常稳定有关，但其关键致癌因子HIF-2α（由 EPAS1 编码）的转录调控机制尚不完全清楚。本文中，研究人员通过整合患者队列的遗传、表观遗传和转录组数据，结合细胞模型实验，鉴定出 EPAS1 上游的致癌性增强子。该增强子的激活依赖于HIF和肾谱系特异性因子（如PAX8和HNF-1β）的存在，从而揭示了HIF-2α通过一个正向自反馈转录调控环路促进肾癌生长的机制，并阐明了遗传易感性变异（如rs12617313）如何通过该环路调节癌症风险，为理解ccRCC的病理机制和靶向治疗提供了新见解。
肾癌，特别是最常见的类型——透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC），其发生发展与一个关键的分子开关密切相关：缺氧诱导转录因子（Hypoxia-Inducible Factors, HIF）。在绝大多数ccRCC中，负责降解HIF的抑癌蛋白VHL（von Hippel-Lindau）功能丧失，导致HIF-α亚基异常稳定，即使在富氧环境下也无法被正常清除。这种“伪缺氧”状态持续激活HIF下游的大量基因，驱动了肿瘤的血管生成、代谢重编程和生长。
在HIF家族中，HIF-2α（由 EPAS1 基因编码）被证明是ccRCC中更关键的致癌驱动因子。然而，一个长期悬而未决的核心问题是：在VHL功能丧失、HIF蛋白稳定之后，是什么机制在转录水平上进一步“放大”了 EPAS1 基因自身的表达？这种转录上调是否具有组织特异性？它又如何与已知的肾癌遗传易感性相关联？理解这一调控机制，对于阐明ccRCC的发病原理、探索超越单纯抑制HIF-2α蛋白活性的治疗新策略，具有重要意义。
为了回答这些问题，一项发表在《自然-通讯》（Nature Communications）上的研究应运而生。研究人员综合利用了大规模患者队列（如TCGA数据库、Erlangen RCC队列）的基因组、表观基因组和转录组数据，并结合了原代分离的肾小管细胞、ccRCC细胞（如786-O、RCC4）和多种细胞系模型进行实验验证。研究的关键技术方法包括：RNA测序（RNA-seq）、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、CUT&Tag-seq、ATAC-seq（测定染色质开放性）、活性接触模型（ABC）分析、单细胞/单核RNA-seq和ATAC-seq数据分析、CRISPR/Cas9基因编辑（用于敲除特定基因或增强子位点）、定量PCR（qPCR）、免疫印迹、报告基因实验，以及在小鼠体内进行的异种移植瘤模型等。
研究结果
ccRCC肿瘤细胞过表达HIF-2α mRNA
研究首先通过分析临床样本（Erlangen队列和TCGA数据）确认，与其他肾癌亚型相比，ccRCC中 HIF-2α (EPAS1) 的mRNA水平显著升高。通过RNAscope原位杂交和分离原代肿瘤细胞证实，这种高表达确实来源于肿瘤细胞本身，而不仅仅是肿瘤内丰富的内皮细胞。
表观遗传学定义了一个ccRCC激活的 EPAS1 增强子
通过在原代ccRCC细胞和肾小管细胞中进行ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq，并结合ABC模型预测增强子-启动子互作，研究人员在 EPAS1 基因上游约70 kb处发现了一个在ccRCC细胞中特异性活跃并与 EPAS1 启动子存在相互作用的增强子区域（文中称为ccRCC激活的增强子或 EPAS1 增强子E2）。该区域在TCGA的ccRCC（KIRC）数据中显示出特异性的染色质开放（ATAC-seq信号）和低甲基化特征，且其开放性与 HIF-2α mRNA表达呈正相关。
HIF-2α mRNA的表达依赖于pVHL和HIF
功能实验表明，在ccRCC细胞中重新表达VHL或敲除HIF-1β（HIF-α的共有二聚化伴侣）会降低 HIF-2α mRNA水平和增强子E2的染色质开放性及活性（H3K27ac信号）。这表明HIF本身正向调节其编码基因 EPAS1 的转录，形成了一个潜在的自反馈环路。
HIF与ccRCC激活的增强子直接相互作用
ChIP-seq/CUT&Tag-seq数据显示，HIF-1α、HIF-1β和HIF-2α直接结合在 EPAS1 基因上游的两个增强子区域：一个位于 PRKCE 基因内含子区（增强子E1），另一个即上文定义的ccRCC特异性增强子E2（包含ATAC-seq位点KIRC_10770）。增强子E2上的HIF结合在肾小管细胞中几乎检测不到，但在多种ccRCC细胞系中非常显著。
EPAS1 增强子与肾癌遗传易感性相互作用
位于 EPAS1 基因内含子的肾癌风险单核苷酸多态性（SNP）rs12617313，其风险等位基因A与肿瘤中更高的 HIF-2α mRNA表达相关，并且在原代肾小管细胞中，携带AA基因型的细胞在HIF被药物稳定后， HIF-2α mRNA的诱导水平更高。这表明遗传背景通过影响HIF依赖的 EPAS1 转录调控来调节癌症风险。
EPAS1 增强子E2的活性依赖于谱系特异性因子
表观遗传学分析发现，肾谱系特异性转录因子PAX8和HNF-1β也结合在增强子E2的区域。敲除 PAX8 或 HNF-1β 基因，或使用CRISPR/Cas9特异性破坏增强子E2上的PAX8/HNF-1β结合位点，均能显著降低 HIF-2α mRNA和蛋白水平，并削弱该增强子的染色质开放性和活性。这揭示了增强子E2的ccRCC特异性激活需要HIF与组织特异性因子的协同作用。
靶向 EPAS1 增强子上的HIF结合基序影响HIF-2α表达及其下游效应
使用CRISPR/Cas9技术敲除增强子E1或E2上的HIF结合基序（HRE），都能降低ccRCC细胞中 HIF-2α 的表达，其中靶向增强子E2的效应尤为显著。对增强子E2进行突变，不仅降低了HIF-2α蛋白水平，还导致一系列经典HIF靶基因（如 VEGFA, CCND1, NDRG1）的表达下调，并显著抑制了786-O细胞在小鼠体内的成瘤能力。RNA-seq和基因集富集分析（GSEA）证实，破坏增强子E2所引起的转录组变化与使用HIF-2特异性抑制剂PT2385处理细胞的效果高度相似。
结论与讨论
本研究揭示了一个驱动肾透明细胞癌发展的关键转录调控环路。该环路的核心是 EPAS1 基因上游的两个增强子（E1和E2），它们直接受其产物HIF-2α蛋白的调控，形成了一个自我强化的正反馈环路。更重要的是，增强子E2的完全激活依赖于肾谱系特异性转录因子PAX8和HNF-1β的协同作用，这解释了为何HIF-2α的异常高表达具有强烈的组织特异性。此外，位于 EPAS1 基因内的肾癌遗传风险变异（如rs12617313）通过影响这一HIF依赖的转录调控，调节了个体对ccRCC的易感性。
这项研究的意义在于，它超越了以往对HIF-2α在ccRCC中仅通过蛋白稳定性调控的认知，首次系统地阐明了其在转录水平上的放大机制。这不仅深化了对ccRCC发病分子基础的理解，特别是将遗传易感性与表观遗传调控、谱系特异性因子联系了起来，也为治疗干预提供了新的思路。靶向这一维持HIF-2α高表达的增强子环路，或利用谱系依赖性的脆弱性，可能成为未来开发更精准、更有效肾癌治疗策略的新方向。
