可点击聚氨基糖：构建刷状透明质酸糖聚合物用于靶向乳腺癌细胞CD44受体

《Biomaterials Science》：Clickable polyamidosaccharides: accessing bottlebrush inspired hyaluronic acid glycopolymers for CD44 targeting of breast cancer cells

这篇论文创新性地合成了具有刷状结构的多价透明质酸（HA）二糖侧链糖聚合物（PAS），用于靶向高表达于多种癌细胞（如乳腺癌）表面的分化簇44（CD44）受体。该合成聚合物具有明确的分子量（MW）和区域选择性，解决了生物来源HA的分子量异质性和污染物问题。研究发现两种具有最高HA二糖接枝率的聚合物能以纳摩尔级亲和力结合CD44，并在CD44高表达的乳腺癌细胞中显示出更强的细胞摄取。将紫杉醇（PTX）与该聚合物结合后，相比游离紫杉醇，在CD44阳性癌细胞中的细胞毒性显著增强，展现出作为靶向药物递送系统的潜力。

　　

可点击聚氨基糖：构建刷状透明质酸糖聚合物用于靶向乳腺癌细胞CD44受体

引言

透明质酸（HA）是一种天然存在的线性非硫酸化糖胺聚糖，由交替的β-1,4-d-葡萄糖醛酸和β-1,3-N-乙酰葡糖胺二糖重复单元组成。它是细胞外基质的主要成分，因其在生理pH下的阴离子特性而提供结构支撑和保水功能。HA的生物相容性、可生物降解性和无毒性使其在转化研究和获批产品中广泛应用。

更重要的是，HA能与跨膜糖蛋白分化簇44（CD44）结合。CD44在多种癌细胞表面过度表达，包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等。在正常组织中，CD44调节细胞生长、存活、粘附、信号传导和运动。在癌组织中，HA与CD44的结合相互作用激活了促进癌症进展和侵袭的信号级联反应，因此CD44表达增加与肿瘤发生和转移呈正相关。过去十年中，大量研究利用HA作为递送系统的靶向配体，以实现肿瘤细胞选择性和有效载荷定位，从而提高疗效并减少脱靶效应。

这些研究通常使用从生物来源分离的HA。然而，生物来源的HA分子量（MW）高度异质，且常携带潜在有害的内毒素和残留生物污染物，这些都会影响生物聚合物的功能和实验的可重复性。完全合成HA的方法可以消除残留生物污染物和内毒素的问题，但这些合成路线冗长，因为低聚物必须至少包含六个单糖重复单元才能有效结合CD44，并且由于需要一系列反应，可扩展性有限。相比之下，一些合成聚合物通过刷状糖聚合物，利用多价性与低分子量HA结合。例如，有研究报告了一种在碳氢聚合物骨架上带有24-单糖多价HA靶向配体的糖聚合物的合成，并通过表面等离子体共振（SPR）证明其CD44结合亲和力显著提高。

聚氨基糖（PAS）是一类新型的多糖模拟物，其中α-1,2酰胺键取代了重复糖单元之间的天然糖苷键。通过反应性β-内酰胺单体的阴离子开环聚合，可以得到无毒、具有受控分子量、窄分布和螺旋二级结构的PAS。PAS的组成和结构为设计功能性活性多糖模拟物提供了机会，这些模拟物保留了其天然对应物的生物相容性、可生物降解性和密集功能性。

本文报道了一种HA启发的PAS的合成和生物活性，用于靶向表达CD44的癌细胞以进行治疗性递送。从设计角度来看，我们采用了一种“可点击”的PAS主链，其中HA二糖通过应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）以多价方式连接到聚合物上。我们描述了一个由HA二糖功能化的均聚物和共聚物组成的碳水化合物基聚合物库的合成。这种带有合成上可获得的HA二糖的刷状PAS能以纳摩尔级亲和力结合CD44，被CD44表达的乳腺癌细胞内化，并在与化疗药物功能化后对此类乳腺癌细胞表现出强效细胞毒性。

结果与讨论

HA二糖侧链的合成

我们的策略是首先合成HA衍生的侧链二糖靶向配体，然后利用SPAAC反应（因其温和、无催化剂、正交性和下游生物相容性）将其连接到PAS上。我们通过制备叠氮臂糖基化受体来合成HA侧链。d-葡萄糖的乙酰化得到化合物1，随后异头中心碘化，接着用硫脲和碘乙烷处理，以优异的产率（85%）得到硫苷2。皂化以及随后的O4和O6苯亚甲基缩醛保护得到二醇3。O2和O3位置用苯甲酰基官能化得到4，它作为亲电子伙伴，在三氟甲磺酸催化下与叠氮乙氧基乙醇在异头位进行亲核加成，得到5。我们通过¹H核磁共振（NMR）J值分析（J_H-1= 7.8 Hz，表明双轴质子取向与β构型一致）确认了β异头立体化学。接下来，三氟乙酸催化的苯亚甲基缩醛脱保护得到二醇6。伯C6羟基通过TEMPO氧化氧化为相应的羧酸，然后进行化学选择性苄基保护，得到受体7。

对于糖基化供体的合成，选择性保护葡糖胺盐酸盐得到亚胺8，进一步乙酰化得到9。亚胺的酸性水解得到乙酰化葡糖胺盐10，允许随后安装N-三氯乙酰基（TCA）基团作为N-乙酰基类似物。路易斯酸介导的硫醇化得到硫苷11。皂化后对O4和O6位置进行苯亚甲基缩醛保护得到硫苷12。O3的苄基化提供13，其经过路易斯酸催化的分子内环化得到恶唑啉供体14。有了糖基化受体和供体后，三氟甲磺酸盐介导的糖基化提供了非对映纯的叠氮臂二糖15。我们再次使用¹H NMR J值分析来确认分离出的二糖的立体化学。由于谱图重叠，我们估计J_H-1′约为～8.7 Hz；然而，根据近似的J值以及观察到的裂分模式，β异构体的存在是明显的。

DBCO功能化连接体的合成

为了功能化聚合物主链，我们接下来合成了一个带有末端二苯并环辛炔（DBCO）的连接体，作为叠氮臂二糖15的应变炔烃对应物。此外，DBCO功能化的连接体需要一个亲电的伯卤化物用于在PAS主链上进行亲核取代，以及足够的柔性以减少可能阻碍侧链二糖与CD44结合的立体相互作用。为了实现这一目标，我们通过首先用2-(2-氨基乙氧基)乙醇取代1-氯-6-碘己烷制备16，然后进行DBCO-N-羟基琥珀酰亚胺偶联，以良好的产率制备了连接体17。

均聚物的合成与表征

为了制备“可点击”多糖模拟物，我们首先对保护的β-内酰胺双环单体进行阴离子开环聚合，得到PAS主链。对于后功能化，我们需要一个伯羟基作为与连接体17以及最终的侧链二糖15偶联的柄，因此，我们使用选择性保护的6-O-三异丙基硅基（TIPS）β-内酰胺18作为单体。在引发剂Cbz-6-氨基己酸五氟苯酯存在下，通过双（三甲基硅基）氨基锂（LiHMDS）催化的18聚合，通过调节单体与引发剂的比例（[M]/[I] = 100:1, 50:1, 25:1），我们得到了具有受控分子量的明确均聚物P1a–P3a。使用四氢呋喃作为流动相，配备直角光散射检测器的凝胶渗透色谱（GPC）显示，测得的聚合度（N）与P1a–P3a的理论N（N_theory）非常接近。聚合后，用1 M TBAF/THF处理选择性地脱去TIPS保护基，得到6-OH聚合物P1b–P3b。使用咪唑在THF中将先前制备的连接体17偶联到O6位置，然后沉淀到冷的正戊烷中，得到P1c–P3c。基于聚合物P1b–P3b到P1c–P3c之间绝对重均分子量（M_w）的增加，接枝效率约为100%。¹H NMR分析进一步证实了接枝效率，表明聚合物H1峰（～5.7 ppm）与连接体酰胺质子峰（～6.0 ppm）的比例约为1:1。准备好连接体取代的聚合物后，我们接下来研究了聚合物P1c–P3c与叠氮臂二糖15之间SPAAC的效率。在冷的正戊烷中沉淀的标准纯化过程不能将聚合物与过量的二糖15分离；然而，在冷的甲醇中沉淀可以去除残留的二糖，除了P2d可溶于冷甲醇。因此，我们在没有进一步纯化的情况下将P2d进行下一步。

用液态氨中的钠金属对聚合物P1d–P3d进行脱保护，然后使用8.0 kDa分子量截止透析膜对去离子水进行透析，并进行冷冻干燥，得到最终的聚合物P1d′–P3d′，为蓬松的白色固体，产率低至中等（13–25%）。P1d′–P3d′通过圆二色性（CD）测定采用螺旋二级结构。¹H NMR光谱证实了芳香族保护基的去除，并且对聚合物H1峰（～5.75 ppm）与侧链HA二糖的异头质子（～4.55 ppm和～4.50 ppm）的积分比进行分析，提供了SPAAC反应接枝效率的近似值。侧链接枝率在13–27%之间。这些结果与脱保护前通过GPC观察到的聚合物P1d–P3d绝对M_w的增加一致。为了计算聚合度（N），我们使用了通过脱保护后聚合物的¹H NMR分析确定的接枝效率；最终的N值与之前步骤计算的N一致，例如N_P1a= 33 和 N_P1d= 31。我们尝试通过提高反应温度或将二糖15的当量从1.5当量增加到2.0当量（相对于一个单体单元）来提高接枝效率，但未成功。使用配备直角光散射检测器和1× PBS作为流动相的水相GPC，我们测定了P1d′–P3d′的绝对M_w，这与先前合成步骤中计算的N非常吻合。GPC分析证实了聚合物在整个脱保护过程中保持完整，并证实了与其受保护聚合物对应物近似的侧链接枝。

共聚物的合成与表征

鉴于均聚物约25%的侧链接枝效率，我们接下来研究了在HA侧链功能化聚合物中穿插葡萄糖单体单元是否会影响SPAAC效率和下游与CD44的结合。因此，我们合成了包含6-O-TIPS内酰胺18和三-O-Bn内酰胺19、单体比例为1:3的共聚物。我们选择单体19，因为苄基在整个聚合后修饰过程中是稳定的，但在最终的全局脱保护中很容易脱苄基化。由于所选单体的聚合动力学存在差异（三-O-Bn内酰胺19在5分钟内完全聚合，6-O-TIPS-3,4-O-PMB内酰胺18在20分钟内完全聚合），我们探索了两种不同的共聚合方法以及一个额外的更高分子量聚合物（N_theory= 200；[M]/[I] = 200/1），以扩展共聚物库的分子量范围并获得可变的支化密度。

方法A涉及在遵循用于均聚的相同聚合程序后同时添加单体。在Cbz-6-氨基己酸五氟苯酯存在下，LiHMDS聚合单体得到共聚物P4a–P7a，产率良好，与均聚物相当，且N值与N_theory一致。考虑到后续步骤中6-O-TIPS单体占25%的组成，我们根据单体18的含量计算试剂当量，而反应浓度基于单体18和19的总毫摩尔数。这种方法成功选择性地脱除了TIPS保护基，以高产率得到聚合物P4b–P7b。观察到的每个共聚物的M_w和计算的N_6-OH与计算的N_6-TIPS共聚物一致。添加连接体17以可观的产率得到聚合物P4c–P7c，相对于6-OH单体单元，接枝效率为100%，这是根据GPC分析中绝对M_w的增加确定的。对于SPAAC，我们将二糖15的当量相对于DBCO从1.5当量增加到2.0当量，以推动反应完成。不幸的是，二糖功能化的共聚物不会在冷甲醇中沉淀，因此，我们将粗聚合物进行下一步脱保护步骤。P4d–P7d的GPC分析显示所有聚合物的M_w均增加，表明SPAAC成功。使用液态氨中的钠金属进行全局脱保护后，用去离子水透析（8.0 kDa MW截止膜）去除任何残留的未偶联二糖。随后的冷冻干燥得到聚合物P4d′–P7d′，为蓬松的白色固体，产率中等（17–36%）。聚合物P4d′–P7d′也通过CD测定采用螺旋二级结构。P4d′–P7d′的¹H NMR分析表明，相对于完整的聚合物主链，接枝效率约为11–15%，但P4d′除外（～3%接枝）。P4d′–P7d′的水相GPC分析显示聚合度N与之前的步骤一致。我们再次使用¹H NMR测定的相对接枝效率计算了脱保护后聚合物的N。

我们假设，与均聚物P1d′–P3d′相比，在共聚物P4d′–P7d′中观察到的侧链接枝减少是由于聚合物序列更具嵌段性，这源于内酰胺18和19聚合动力学的差异。这种差异可能产生具有更高空间限制和密集支化的聚合物，类似于均聚物，阻碍了侧链二糖的完全接枝，因此我们探索了第二种聚合方法。

第二种聚合方法，方法B，解决了我们单体聚合动力学不同的问题，以提供相对于聚合物P4–P7更随机的序列。在这里，我们首先单独引发6-O-TIPS内酰胺18的聚合（由于其较慢的聚合动力学，单体在20分钟内完全消耗），然后在20分钟内间歇添加三-O-苄基内酰胺19，每次0.5 mL等分试样。这些等分试样确保所有溶液中单体单元的聚合浓度约为0.1 M，并且6-O-TIPS内酰胺18与三-O-苄基内酰胺19的最终单体比例为1:3，与方法A中使用的相同。同样，在Cbz-6-氨基己酸五氟苯酯存在下，LiHMDS聚合单体得到共聚物P8a–P11a，产率良好，具有分子量控制。然而，与共聚物P4a–P7a相比，分散度增加，我们假设这是顺序添加内酰胺19的结果。我们对共聚物P8–P11采用了与P4–P7相同的聚合后合成步骤。硅基脱保护以高产率得到P8b–P11b，其N_6-OH与N_6-TIPS一致。添加连接体17提供共聚物P8c–P11c，根据GPC分析中绝对M_w的增加确定，相对于每个6-OH单体单元具有完全接枝。与二糖15的SPAAC导致所有共聚物P8d–P11d的M_w增加，表明成功接枝。和之前一样，共聚物P8d–P11d不会在冷甲醇中沉淀，并被进行到全局脱保护步骤。用去离子水透析（8.0 kDa MW截止膜）去除任何残留的二糖。随后的冷冻干燥得到共聚物P8d′–P11d′，为白色蓬松固体，产率中等（13–36%），通过CD测定具有螺旋二级结构。P8d′–P11d′的¹H NMR分析显示，相对于通过方法A合成的相应共聚物，侧链二糖的接枝有所改善，这与总体空间位阻的降低和局部支化密度的降低一致。例如，P10d′的侧链二糖相对于可点击单体单元（方法B，N_theory= 100）的接枝效率为96%，而P6d′（方法A，N_theory= 100）为72%，P3d′（均聚物，N_theory= 100）为20%。有趣的是，对于所有通过两种方法制备的共聚物，侧链二糖的接枝百分比随着N的增加而增加，直到N= 100，然后在N= 200时略有下降。水相GPC再次证实了共聚物P8d′–P11d′的近似二糖接枝和绝对M_w，这由N值表明，该值与之前的步骤一致，并基于通过¹H NMR测定的二糖接枝百分比。

CD44结合研究和细胞毒性

准备好聚合物库后，我们接下来使用生物层干涉测量法（BLI）测量了HA二糖偶联聚合物与CD44的结合亲和力，并与天然HA的结合亲和力进行了比较。我们将CD44-Fc固定在AHC Octet（抗Fc）传感器上，浓度为10 μg mL^?1，在1× PBS + 0.005% Tween-20中。然后我们将固定的CD44传感器在浓度递增的聚合物溶液中孵育，以测量结合动力学（k_on），随后在缓冲液中孵育以确定解离动力学（k_off），从中我们计算了结合解离常数（K_D）。P1d′和P10d′发生CD44结合，K_D值分别为3.79 ± 0.43 nM和9.88 ± 0.96 nM。与天然HA（8–15 kDa；K_D= 0.123 ± 0.02 nM）相比，结合亲和力的下降对于P1d′和P10d′分别约为30倍和80倍。有趣的是，P1d′和P10d′在聚合物库中也表现出最高的侧链HA二糖接枝率，分别为27%和24%。此外，我们尝试测量高分子量HA（1.5–1.75 MDa）与CD44的结合亲和力；然而，我们无法完成BLI实验，因为HA在10–100 μM浓度下会形成粘性凝胶状物质。使用SPR作为测量技术，其他组报告K_D在10–100 μM之间。作为阴性对照，glc_OHPAS显示不与CD44结合。

确认CD44结合活性后，我们通过用浓度范围为0.0001–1.0 mg mL^?1的聚合物溶液处理NIH 3T3小鼠成纤维细胞来评估P1d′的细胞毒性。我们将细胞与聚合物溶液一起孵育24小时，然后通过测量DNA含量来确定细胞增殖。HA（8–15 kDa）无细胞毒性，而P1d′在高达0.5 mg mL^?1时无细胞毒性，在1.0 mg mL^?1时略微降至78%的活力。

透明质酸酶降解研究

透明质酸酶（HAase）容易降解HA，产生分子量较小的物种，这些物种表现出体内滞留时间缩短和不同的生物活性。例如，在肿瘤微环境（TME）中，HAase浓度增加导致低分子量HA积累。因此，依赖天然HA的CD44靶向癌症递送系统容易降解并失去靶向效率。考虑到这一点，我们进行了HAase降解研究，以辨别潜在的酶促降解，使用了每种合成方法中的一种聚合物：P1d′、P4d′和P8d′。

我们将聚合物和HA（8–15 kDa）在含有或不含HAase的1× PBS（pH 7.4）中于37°C孵育24小时。接下来，我们冷冻干燥并通过配备折射率检测器和1× PBS作为洗脱液的GPC分析聚合物。正如预期，HAase降解HA，这由GPC保留时间的增加所证明。相比之下，HAase不降解聚合物P1d′、P4d′和P8d′，因为GPC保留时间没有偏移。在仅用PBS孵育的P4d′和P8d′中出现了略微更小的分子量峰，表明共聚物中发生了一些水解，但均聚物中没有。然而，PBS对照样品和HAase样品之间缺乏偏移，表明聚合物对酶促降解具有抗性。这种对HAase降解的抗性可能是由于缺乏糖苷键以及在刚性螺旋二级结构中存在酰胺键，从而保护其免受酶促降解。进一步支持这种屏蔽机制的是，与线性对应物相比，订书肽糖类表现出更高的酶稳定性。

体外CD44介导的内化研究

鉴于P1d′对CD44具有低纳摩尔亲和力，我们进一步研究了其在三种具有不同表面CD44表达的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-453）中的结合和随后的细胞内容。在高度侵袭性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中存在显著更高的CD44表达。同时，MCF-7和MDA-MB-453细胞系分别具有中等和低CD44表达。首先，我们通过免疫荧光共聚焦显微镜确认了所有三种细胞系的CD44表达。正如预期，CD44表达在MDA-MB-231细胞系上最高，其次是MCF-7细胞系上明显的中等表达，以及MDA-MB-453细胞上的低表达，尽管不显著。

为了确定潜在的细胞摄取，我们对P1d′进行荧光标记（rho-P1d′），以便通过共聚焦显微镜观察，并以罗丹明标记的HA（rho-HA）和glc_OHPAS（rho-glc_OHPAS）作为阳性和阴性对照。在全局脱保护后，聚合引发剂中的CBz保护基被移除，得到一个可功能化的伯胺。荧光标记是通过将5-羧基-X-罗丹明N-琥珀酰亚胺酯与该末端胺反应来实现的，得到rho-P1d′。过量的罗丹明通过使用2.0 kDa MW截止透析膜对去离子水透析去除。我们用250 μg mL^?1的rho-P1d′、rho-HA和rho-glc_OHPAS处理每个细胞系6小时。用rho-P1d′处理的MDA-MB-231细胞显示聚合物存在于细胞质中，并且与rho-glc_OHPAS相比，荧光显著增加。P1d′的相对荧光在MDA-MB-231细胞内最高，在MCF-7和MDA-MB-453细胞中显著降低。这些数据表明，P1d′的受体介导内容依赖于CD44细胞表面表达。

P1d′在CD44阳性癌细胞中的内容支持了其作为治疗性递送系统潜力的评估。因此，我们将化疗药物紫杉醇（PTX）与聚合物结构结合，并研究了其将PTX递送至表达CD44的乳腺癌细胞的能力，以提高疗效并减少脱靶细胞死亡。PTX是治疗乳腺癌最常用的化疗药物之一，因为它抑制微管解聚，导致细胞周期停滞并最终导致细胞死亡。然而，PTX存在显著局限性，包括溶解度差，需要使用聚乙氧基化蓖麻油和脱水乙醇（Cremophore EL）或白蛋白（Abraxane）进行递送，以及由于健康和癌细胞均受影响而导致的