《Biotechnology and Bioengineering》：Hidden O-Deglycosylation Activity Triggers O?→?C Rearrangement for Aryl Di-C-Glucoside Formation by the C-Glycosyltransferase From Fortunella crassifolia
1引言
重排反应在有机合成中备受推崇，因其展现出优异的原子经济性。在生物催化领域，一个著名的例子是酶法将蔗糖转化为糖尿病甜味剂异麦芽酮糖，这是重排过程大规模工业应用的典范。本研究深入探讨了酚类O-糖苷重排为相应芳基C-糖基衍生物的过程，并利用这一重排开发了高效合成二-C-糖基化合物的路线。O→C糖苷重排由一种依赖糖核苷酸的糖基转移酶催化，在黄酮类化合物根皮素（phloretin, 1）上进行。
黄酮类化合物在生物系统中常以糖基化代谢物形式存在。C-糖基黄酮类化合物与其O-糖苷对应物不同，它们能够抵抗水解。对于医药、营养和化妆品应用，与C-糖基化相关的延长代谢半衰期通常是有利的。然而，从天然来源获取C-糖基黄酮类化合物受到其相对较低丰度的限制。因此，合成策略通常依赖于使用适当的糖基供体对黄酮苷元进行C-糖基化。尽管O-糖苷的O→C重排为合成C-糖基化合物提供了一条有前景的途径，但其实际应用需要高效的（生物）催化方法。
酶促O→C重排——最初由Gutmann等人证实——通过黄酮O-糖苷脱糖基化，随后在一锅级联反应中进行C-糖基化。这个两步转化需要O-和C-糖基转移酶的联合活性，可以来自具有不同特异性的一对合适酶，也可以来自具有灵活O/C特异性的单一酶。催化量的核苷酸（例如尿苷5'-二磷酸，UDP）充当可转移糖基残基的“分子穿梭机”。值得注意的是，Dai及其同事对来自芒果（Mangifera indica）的O/C双特异性糖基转移酶（MiCGT）的研究表明，O-糖基转移酶活性仅在O-糖苷脱糖基化方向上可检测到，这与O-糖基化的逆反应相对应。这种隐藏的活性之所以出现，是因为该酶对C-糖基化的强烈偏好完全抑制了对黄酮类受体的O-糖基化。
黄酮类化合物的O→C糖基重排在能量上是下坡的，平衡几乎完全偏向C-糖基产物一侧。O→C重排用于C-糖基黄酮合成的潜力也在纯化学方法中得到认可。然而，酶催化过程的明显优势在于对C-糖基化步骤的位置和α/β立体化学控制。
本研究显示，来自厚叶金柑（kumquat）的C-糖基转移酶（FcCGT）在UDP存在下催化根皮苷（phloretin 2′-β-O-glucoside, 2）发生O→C重排，生成诺托皂苷（nothofagin, phloretin 3′-β-C-glucoside, 3）。当额外供应UDP-葡萄糖时，C-糖基化进一步进行，生成根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）。由于O-糖基化的根皮素比游离的根皮素苷元溶解度要高得多，通过O→C重排进行C-葡萄糖苷合成，消除了对有机共溶剂或包合物增溶等策略的需求。优化的重排-糖基化反应以高产率合成了根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷，浓度高达25 mM（15 g/L）。
2材料与方法
实验所用根皮苷二水合物和三叶苷（trilobatin, phloretin 4′-β-O-glucoside, 5）分别购自Carbosynth和TCI公司。纯化的FcCGT和来自大豆（Glycine max）的蔗糖合酶（GmSuSy）通过大肠杆菌过表达培养获得，酶纯度经SDS-PAGE确认。
酶促反应一般在100 μL总体积中进行，使用含10 mM 2-巯基乙醇作为还原剂的50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5或8.0），可选择性添加DMSO作为共溶剂。通过微波加热促进底物溶解。在不同时间点取样，用甲醇淬灭反应，离心后取上清液进行HPLC分析。
使用配备C18柱的HPLC-UV系统分析根皮素及其糖苷，检测波长为288 nm。使用等度方法分析UDP-葡萄糖和UDP，检测波长为262 nm。通过计算各峰面积相对于HPLC色谱图中总峰面积的比例来确定反应组分的相对比率，然后通过将初始底物浓度乘以相应的相对比率来估算产物浓度。
对于根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的合成，反应条件为：2.0 mM根皮苷（4% DMSO为共溶剂），4.0 mM UDP-Glc，0.50 mg/mL FcCGT，在pH 8.0的磷酸钾缓冲液中，30°C反应。反应完成后，使用超滤管去除酶，旋转蒸发除去溶剂，通过制备型HPLC分离产物。通过HPLC-MS和NMR（1H和13C）对产物进行表征，其化学位移与文献值一致。
3结果与讨论
3.1根皮苷意外转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷
先前研究表明，FcCGT与UDP-葡萄糖和根皮素（1）反应，以高产率（≥95%）单一地生成根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）。FcCGT对C-糖基化表现出严格的特异性，而在所有测试条件下均未检测到根皮素的O-糖基化。此外，根皮素的C-糖基化完全局限于底物的A环。
为了进一步评估FcCGT的合成效用，研究人员检测了根皮苷（1.0 mM）与UDP-葡萄糖（2.0 mM）在pH 8.0下的酶促反应，假设可能会形成混合的二-O,C-葡萄糖苷。然而，根皮苷转化只产生单一产物。经过分离和通过HPLC-MS和NMR进行结构表征后，该产物被鉴定为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷。该产物的形成意味着一个酶促过程，其中根皮素发生了双C-糖基化，并以天然的β-O-葡萄糖苷为代价。研究人员假设，根皮苷（2）通过2′-O→3′-C重排形成诺托皂苷（3）是最终导致根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的起始步骤。
3.2根皮苷脱糖基化驱动根皮苷的O→C重排
对根皮苷（2）转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）进行了详细分析。反应时间过程数据显示，底物2直接转化为产物4，在应用的HPLC条件下未检测到中间体。UDP-葡萄糖的消耗与根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷的释放呈1:1摩尔比，表明产物中的一个葡萄糖基单元来源于根皮苷。
从根皮苷反应的初始速率确定，转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷的比活性为3.1 ± 0.3 mU/mg。这一结果表明，根皮苷转化受到一个比直接从UDP-葡萄糖进行C-糖基化慢100倍以上的过程限制。
对照实验显示，在没有UDP-葡萄糖的情况下，根皮苷不发生转化。所提出的O→C糖苷重排机制需要一个由UDP促进的初始O-脱糖基化步骤。UDP-葡萄糖制备物中含有少量UDP（约占UDP-葡萄糖总量的0.5%），这可能足以启动酶促根皮苷脱糖基化。
基于Gutmann等人和J. Chen等人的研究结果，他们表明O-糖苷被UDP脱糖基化在低pH下在热力学上更有利，研究人员在pH 6.5下进行了FcCGT与根皮苷和UDP-葡萄糖的反应。在此条件下，转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷的比活性增加了三倍，达到9.4 ± 0.3 mU/mg。值得注意的是，诺托皂苷（3）现在可作为单C-糖基化中间体被检测到。
为了进一步研究UDP在酶促过程中的作用，研究人员在一个反应体系中进行了FcCGT与根皮苷的反应，同时加入了蔗糖合酶的UDP消耗反应（蔗糖 + UDP → UDP-葡萄糖 + 果糖）。GmSuSy以三倍于FcCGT的质量浓度添加，蔗糖以大量过量（500 mM）供应。在存在蔗糖合酶反应的情况下，根皮苷转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷的速度减慢了4.5倍。在这些条件下，UDP通过HPLC无法检测到。该结果支持了UDP是通过脱糖基化启动根皮苷转化的“活性”底物的观点。
3.3根皮苷与UDP的反应
在pH 8.0、存在UDP（2.0 mM）的条件下进行了FcCGT与根皮苷（2，1.0 mM）的反应。HPLC分析显示，8小时后底物2有70%转化为单C-糖苷诺托皂苷（3）。根皮素（1）和根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的释放量很小。从UDP形成UDP-葡萄糖的量极少，这解释了根皮苷中β-葡萄糖基的有效转化（重排），其驱动力是强烈有利于C-糖基化的反应平衡。
完整的反应时间过程显示，根皮苷转化为诺托皂苷。产物1和4始终保持在低水平。与UDP-葡萄糖的根皮苷反应（其进程几乎与时间呈线性关系）相反，UDP反应在转化仍不完全时（≤40%），初始产物释放速率在大约2小时后下降了约三倍。反应减慢的可能原因是UDP-葡萄糖的耗竭，这表明根皮苷脱糖基化停止，大概是因为诺托皂苷作为与根皮苷竞争的抑制剂。当在反应开始时以0.5 mM浓度添加诺托皂苷时，与对照反应相比，根皮苷消耗速率降低了约两倍，这与它作为抑制剂的假设作用一致。
然后，研究人员在较高浓度（10 mM）和UDP摩尔过量（1.0 mM；10%）的条件下检测了根皮苷（2）的转化，使用3.0 mg/mL FcCGT。pH降至6.5以促进限速的O-脱糖基化。如图所示，诺托皂苷（3）的释放24小时后仍不完全（~40%产率），原因是产率随时间推移逐渐下降。较高的FcCGT浓度（5.0 mg/mL）提高了产量（24小时后约60%产率），但反应减慢的影响仍然存在。大约2%的诺托皂苷在此时点已发生第二次C-糖基化，形成根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）。在这些条件下，无法实现将根皮苷（2）O→C重排为单一产物诺托皂苷（3）的精确控制。由于优先考虑二葡萄糖苷的合成，因此未对反应进行进一步优化。
3.4与根皮素4′-β-O-葡萄糖苷的反应
测试了三叶苷（根皮素4′-β-O-葡萄糖苷，5）作为FcCGT在pH 8.0、存在UDP-葡萄糖（2.0 mM）条件下的底物（1.0 mM）。条件与产生根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）作为产物的根皮苷（2）反应相同。如果三叶苷是FcCGT通过UDP进行O-脱糖基化的底物，则预期会得到相同的二葡萄糖苷产物4。在另一种情况下（不发生O-脱糖基化），由于从UDP-葡萄糖对三叶苷进行C-糖基化，可能会形成混合的O/C-二葡萄糖苷。
在酶促反应中检测到一种先前未报道的产物6，它不同于根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4），是与三叶苷反应的主要产物。产物4也被检测到，但仅以痕量存在。新化合物6的质谱图给出了分别对应于二糖基化和单糖基化根皮素衍生物的峰。相比之下，已确定的根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）只表现出与二-C-葡萄糖基化产物相关的m/z 599，表明新产物很可能是根皮素3′-β-C-葡萄糖基-4′-β-O-葡萄糖苷（6）。未对该产物进行分离。
这些发现揭示，三叶苷不是FcCGT进行O→C重排的相关底物。该酶似乎在根皮素O-葡萄糖苷的脱糖基化中对2′-O位点具有特异性。D. Chen等人在使用来自芒果（M. indica）的C-糖基转移酶（MiCGTb）时也发现，该酶对根皮素及相关三羟基芳基化合物的2′-O-葡萄糖苷的脱糖基化具有明显的位点选择性。MiCGTb反应显示出4′-β-O-葡萄糖苷的O→C重排，但转化率远低于相应的2′-β-O-葡萄糖苷。FcCGT与MiCGTb的重要区别在于其形成二葡萄糖苷的能力。这些C-糖基转移酶的特定底物特异性的分子基础尚不明确，是未来研究的一个有趣课题。
在pH 8.0下，利用三叶苷转化和产物6形成的时间过程，确定FcCGT的比活性为1.26 ± 0.03 mU/mg。UDP-葡萄糖的消耗与二葡萄糖苷产物的释放密切匹配，表明在所用条件下，糖核苷酸供体底物的水解（糖基转移酶在与不良受体底物反应时常见的副反应）并未变得与向三叶苷的糖基转移竞争。当使用较低的pH 6.5时，产物4在总产物中的比例从10%增加到15%，表明在这些条件下4′-O-脱糖基化可能得到增强。
3.5耦联O→C重排和C-糖基化以实现高效的根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷合成
FcCGT与根皮苷和UDP-葡萄糖的反应以定量产率单一地生成了根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）。根皮苷转化为产物4的效率比其转化为诺托皂苷更高。将根皮苷的O→C重排与诺托皂苷的C-糖基化相耦合对于整体转化效率很重要，可能是因为消除了产物抑制对重排的影响。因此，研究人员试图将这一酶促过程应用于更高浓度（≥10 mM）的根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的合成。C-糖基化所需的UDP-葡萄糖由GmSuSy反应提供，使用UDP（1.0 mM）和蔗糖（100 mM）作为底物。FcCGT和GmSuSy在pH 6.5、30°C下一锅使用，FcCGT与GmSuSy的质量比为2:1。
根皮苷（2）转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的反应时间过程显示，底物2（10 mM）在16小时内完全转化为产物4。未检测到根皮素（1）和诺托皂苷（3）。转化率达到~100%，且反应速率没有下降。请注意与根皮苷重排为诺托皂苷的区别，后者表现出显著的反应减慢效应。
UDP和UDP-葡萄糖的动态显示，在反应开始时，添加的UDP中约95%以UDP-葡萄糖形式存在，表明通过GmSuSy从蔗糖反应有效供应了C-糖基化供体底物。总核苷酸在UDP和UDP-葡萄糖之间的分布随时间变化，UDP的量增加，但UDP-葡萄糖始终以超过UDP（≥5倍）的量存在。另一方面，UDP也存在以促进O→C重排。
然后，研究人员将根皮苷浓度提高到25 mM，这大致是所用条件（5% DMSO；30°C）下的溶解度极限。底物2转化为根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的进程几乎与时间呈线性关系，24小时后达到~50%。与10 mM反应相比，转化率降低了15%，尽管使用了1.4倍更高的FcCGT浓度。重要的是，单C-糖基化中间体诺托皂苷（3）在24小时后累积到初始根皮苷的约3%，表明中间体3的C-糖基化速率在25 mM根皮苷条件下降低了。UDP-葡萄糖和UDP在反应过程中的演变表明，与10 mM反应相比，UDP-葡萄糖达到其占总核苷酸最大份额（~95%）所需的时间要长得多（≥1小时）。此后，UDP-葡萄糖的份额在反应过程中持续下降。UDP-葡萄糖与UDP的摩尔比平均比10 mM根皮苷反应中低约40%。UDP-葡萄糖的可用性降低可能解释了根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）形成速率下降的原因。
3.6根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷合成的反应强化
为了在25 mM根皮苷（2）条件下提高根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）生产的转化率，研究人员考虑将温度从标准30°C提高到40°C。在40°C下，产物4在0–12小时期间的生成速率增加了四倍，根皮苷的完全转化在12–16小时内实现，对应于根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷（4）的时空产率约为2 mM/h。中间体诺托皂苷（3）在8小时后累积到约0.5 mM（相当于初始根皮苷的~2%），随后完全转化为产物4。
在反应开始时，添加的UDP中几乎全部（~90%）以UDP-葡萄糖形式存在，表明GmSuSy活性因温度升高而增强。UDP-葡萄糖与UDP的比率下降得比30°C反应中更快，在反应结束时达到约1.3。UDP-葡萄糖份额的逐渐下降可能反映了GmSuSy接近平衡，当FcCGT反应因受体底物耗尽而减慢时。
最后，研究人员考虑了底物溶解度的重要问题。根皮素（1）在水中的溶解度很差（35°C时约0.6 mM）。因此，在任何基于根皮素直接C-糖基化的工艺中，都需要提高底物溶解度。先前的研究显示了使用环糊精形成包合物将根皮素溶解度提高到50-120 mM。也考虑了各种有机共溶剂，使用20% DMSO可将根皮素溶解度提高到约10 mM。使用有机共溶剂涉及到溶解度增强与酶活性和稳定性降低之间的复杂权衡，正如许多糖基转移酶研究所表明的那样。使用环糊精通常可以避免对酶的负面影响，但需要通过额外的步骤形成包合物而使工艺复杂化。此外，在下游加工过程中必须去除和回收环糊精。
糖基化是提高难溶性苷元溶解度的天然策略。基于O→C重排的工艺可以通过设计使用O-糖基化底物来克服溶解度问题。根皮苷（40°C时约32 mM）的溶解度大约是根皮素的60倍。因此，研究人员在40°C、无DMSO共溶剂的条件下进行了25 mM根皮苷反应。
有DMSO和无DMSO条件下底物2转化为产物4的总体概况非常相似，表明不再需要使用共溶剂。根皮苷被完全消耗，产物产率为定量。检测到少量诺托皂苷（约1.0 mM），并在反应后期完全转化。无DMSO的反应以略低的速率进行。两个反应之间的差异主要在于UDP-葡萄糖和UDP的分布，无DMSO的反应中UDP-葡萄糖的比例更高。重要的是，根皮素3′,5′-二-β-C-葡萄糖苷释放的时间过程略呈S形，最大转化率仅在几小时后达到。在此时点，总核苷酸的约20%以UDP形式存在。结果表明，根皮苷脱糖基化速率最初受到可用UDP的限制。这些发现意味着，初始UDP浓度及其在反应过程中在UDP-葡萄糖和UDP之间的分布是微调整个转化过程的明确参数。
考虑到已报道的FcCGT对于从UDP-葡萄糖进行C-糖基化的苷元底物特异性，本研究中展示的根皮素的2′-O→3′-C重排也可能适用于其他具有2,4,6-三羟基苯乙酮核心结构的2′-O-葡萄糖基化化合物。利用蛋白质工程进一步扩展该酶的底物接受范围，O→C重排的合成策略可能发展成为一个生产各种黄酮二-C-葡萄糖苷的技术平台。进一步的工艺开发可以基于与酶回收相结合的连续生物催化反应。Liu等人展示了来自水稻（Oryza sativa）的C-糖基转移酶和GmSuSy的共固定化。固定化的双酶系统已用于诺托皂苷的克级流动合成。类似的共固定化策略可能适用于FcCGT与GmSuSy的组合。
