空间多组学揭示肝细胞癌复发相关细胞网络与通路：聚焦INTS6+内皮细胞与肿瘤细胞的共定位

《JHEP Reports》：Multiomics and multi-region spatial transcriptome analysis reveal cellular networks and pathways associated with HCC recurrence

为了揭示肝细胞癌（HCC）术后高复发率的潜在机制，研究人员利用多区域空间转录组学和多组学技术，首次在复发性HCC患者原发肿瘤中发现了一类独特的INTS6+内皮细胞（EC）。该细胞与肿瘤细胞在微血管侵袭（MVI）区域显著共定位，其基因特征与患者不良预后相关。这项研究发表于《JHEP Reports》，为理解HCC复发提供了新的细胞空间图谱，并指出了潜在的干预靶点。

　　

肝细胞癌是全球范围内最常见的癌症之一，其诊断率虽高居全球第六，但却是癌症相关死亡的第三大原因。一个重要原因在于，超过一半的患者在被诊断时已处于中晚期，错过了最佳治疗窗口。即使对于能够接受以治愈为目的手术切除的早期患者，预后依然不容乐观，中位5年总体生存率低于70%，罪魁祸首便是高企的复发率。传统的术后辅助疗法效果有限，且目前缺乏有效的预测性生物标志物来指导患者分层和治疗选择。究其根源，肝癌具有高度的病因学和分子异质性，其复杂的肿瘤微环境（TME）内部，各类细胞如何相互作用、空间上如何排布，以及这些因素如何驱动复发，我们知之甚少。单细胞RNA测序（scRNA-Seq）等技术揭示了TME中的细胞多样性，但丢失了至关重要的空间位置信息。为了填补这一空白，一项发表于《JHEP Reports》的研究应运而生，旨在利用前沿的空间技术，绘制出与肝癌复发相关的“细胞地图”。

为了构建这张精细的细胞地图，研究人员利用了一项名为PLANet 1.0的前瞻性、多国队列研究的样本资源。他们采用了多区域空间转录组学分析，对来自4名HCC患者的17份组织样本（其中3名在术后早期复发，1名长期无复发）的多个独立区域进行了高精度的空间基因表达谱分析。同时，为了进行广泛验证，研究者还对队列中90名患者的329个肿瘤区域进行了批量RNA测序。在关键的验证环节，研究人员对独立的患者样本（49例用于多路免疫组织化学，53例用于免疫荧光）进行了检测，以确认关键的细胞空间关系。主要技术路径包括：10X Genomics Visium空间转录组学分析，用于描绘细胞在组织原位的空间分布和基因表达；生物信息学方法（如AUCell、CellTrek、CellChat）用于细胞类型注释、空间共定位分析和细胞间通讯推断；以及多路免疫组织化学和免疫荧光技术，在蛋白质水平上对关键发现进行验证。

研究结果

实验设计、临床病理特征与临床轨迹

研究首先从PLANet 1.0队列中选取了具有代表性的样本，包括来自1名无复发患者和3名早期复发患者的多个肿瘤区域进行空间转录组学分析。所有患者均为Child-Pugh A级并接受了R0切除，但复发的患者通常具有更大的肿瘤、卫星结节或更晚的TNM分期等不利特征。这强调了在理解复发时，考虑肿瘤异质性的重要性。

空间转录组学揭示了HCC患者肿瘤中存在广泛的瘤内分子异质性

通过聚类分析和细胞类型富集评分，研究团队发现在同一患者的不同肿瘤区域之间，甚至同一肿瘤的不同区域内，细胞类型的丰度都存在显著差异，例如肝细胞、髓系细胞、成纤维细胞和内皮细胞的比例在不同区域波动很大。这证实了多区域取样对于捕捉肿瘤的完整复杂性至关重要，单点取样可能严重低估肿瘤内部的异质性，进而影响对疾病生物学和预后的判断。

独特的INTS6⁺内皮细胞亚群与肿瘤复发相关

深入分析显示，肿瘤间质细胞群的差异与疾病复发相关。特别是，一种表达Integrator Complex Subunit 6基因的内皮细胞亚群——INTS6⁺ECs，在复发病人的肿瘤中显示出更高的丰度趋势，而CXCL10⁺的巨噬细胞则在无复发患者的肿瘤中更丰富。这一发现提示了不同的细胞亚群在疾病进程中的潜在不同作用。

肿瘤-间质邻域分析揭示INTS6⁺/PLVAP⁺ECs在复发性患者原发肿瘤中与肿瘤细胞紧密相邻

空间共定位分析取得了关键性发现。在复发的三名患者中，至少有一个肿瘤区域显示INTS6⁺ECs和另一类内皮细胞亚群PLVAP⁺ECs与肿瘤细胞在空间上非常接近，而这种模式在无复发患者的任何区域中均未观察到。这一现象通过多路免疫组化（mIHC）在独立的49例患者队列中得到了验证：在复发患者中，INTS6⁺CD31⁺的内皮细胞更倾向于定位在HEPPAR1⁺肿瘤细胞的5微米范围内。进一步分析这些具有侵袭性的肿瘤区域（即存在INTS6⁺ECs与肿瘤细胞共定位的区域）的基因表达，发现了一系列与细胞增殖、迁移、血管生成和免疫逃逸相关的信号通路被显著上调。

INTS6⁺ECs是一个独特的内皮细胞亚群，其基因特征与HCC复发相关

研究证实INTS6⁺ECs是表达经典内皮标志物的、真正的内皮细胞，且通过轨迹分析被证明是一个区别于PLVAP⁺等其他内皮亚群的独特群体。与其它内皮细胞相比，INTS6⁺ECs中有516个基因表达上调，这些基因富集在TNF-α信号通过NF-κB、缺氧、补体等通路，提示其可能处于一个炎症-缺氧状态。更重要的是，基于INTS6⁺ECs特征基因构建的风险评分，在PLANet 1.0和TCGA（癌症基因组图谱）两个独立的HCC队列中，均能显著区分出总生存期（OS）和无复发生存期（TTR）更差的高风险患者群。

INTS6⁺内皮细胞在复发性患者的微血管侵袭区域富集

微血管侵袭（MVI）是HCC复发的重要预测指标。研究团队发现，在复发患者的原发肿瘤中，病理学家标注的MVI区域恰好富含INTS6⁺ECs。利用微血管侵袭标志物Stathmin 1进行的免疫荧光分析进一步证实，在53例患者中，复发患者肿瘤MVI区域（STMN1⁺）内INTS6⁺CD31⁺内皮细胞的比例显著高于非复发患者。这表明INTS6⁺ECs与导致复发的关键病理过程——微血管侵袭密切相关。

预测的INTS6⁺ECs与肿瘤细胞之间的配体-受体相互作用

为了探究INTS6⁺ECs如何影响肿瘤细胞，研究进行了配体-受体互作分析，发现INTS6⁺ECs与肿瘤细胞之间存在多个显著的相互作用对，其中ANGPTL4（血管生成素样蛋白4）与SDC1（多配体蛋白聚糖1）的相互作用信号最强。功能实验表明，在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中敲低INTS6，会显著减少多种侵袭性HCC细胞系的迁移能力。反过来，使用富含ANGPTL4的条件培养基处理HCC细胞，则能促进其迁移。此外，在HUVEC细胞中敲低INTS6会导致ANGPTL4表达下调，证实INTS6正向调控ANGPTL4。这些结果揭示了一个新的细胞间作用轴：INTS6⁺ECs可能通过分泌ANGPTL4作用于肿瘤细胞上的SDC1受体，从而促进肿瘤细胞的侵袭性行为。

结论与讨论

本研究首次通过对多区域肝癌样本进行空间转录组学分析，构建了与术后复发相关的细胞空间图谱。其核心结论是：在术后早期复发的HCC患者原发肿瘤中，一种独特的INTS6⁺内皮细胞亚群与肿瘤细胞在空间上显著共定位，并富集于微血管侵袭区域。该细胞亚群的基因特征与患者的不良预后（总生存期缩短、复发时间提前）紧密相关。机制上，INTS6⁺ECs可能通过ANGPTL4-SDC1配体-受体轴与肿瘤细胞进行通讯，促进肿瘤细胞的迁移。这些发现具有多重重要意义。首先，它揭示了肿瘤微环境中一种此前未被重视的细胞间相互作用，为理解HCC复发提供了新的细胞生物学视角。其次，INTS6⁺ECs及其基因特征，或ANGPTL4-SDC1相互作用轴，有望成为预测HCC术后复发的新型生物标志物，有助于筛选高危患者进行强化治疗或临床试验。最后，本研究为开发新的治疗策略指明了方向，即靶向肿瘤血管内皮细胞的特定亚群（如INTS6⁺ECs）或阻断其与肿瘤细胞间的关键通讯通路（如ANGPTL4-SDC1），可能成为预防或延缓HCC术后复发的新途径。这项研究不仅深化了对HCC空间异质性和复发机制的理解，也为未来的转化医学研究提供了宝贵的资源和潜在靶点。