高致病性禽流感A(H5N1)病毒导致挪威黑腿三趾鸥大规模死亡事件(2023)解析
中文标题：挪威黑腿三趾鸥大规模死亡事件揭示高致病性禽流感H5N1病毒株EA-2022-BB的致命病理机制与种群威胁
《Transboundary and Emerging Diseases》：Highly Pathogenic Avian Influenza A (H5N1) Caused Mass Death Among Black-Legged Kittiwakes (Rissa tridactyla) in Norway, 2023
编辑推荐：
本研究对2023年挪威北部Ekker?y黑腿三趾鸥繁殖地爆发的高致病性禽流感(HPAI)疫情进行了全面的病理学与病毒学分析。文章证实此次大规模死亡事件由H5N1分支2.3.4.4b病毒基因型EA-2022-BB引起，导致至少1.5万只鸟类死亡，种群数量锐减超过50%。研究者描述了以神经系统症状为主的临床表现，并通过尸检、免疫组织化学(IHC)、原位杂交(RNA-ISH)等技术揭示了病毒导致急性致命性全身性疾病，在大脑和胰腺造成严重病变并与病毒RNA/抗原共定位。病毒受体分布研究表明血管内皮细胞表达α2,3-连接的唾液酸(SA)，这可能反映了病毒的血源性传播。病毒遗传分析显示其为鸟类适应性毒株，未发现关键的哺乳动物适应性突变。文章强调了此次疫情对濒危物种的长期影响，并讨论了基于“一体化健康”(One Health)理念的疫情管理和缓解措施。
引言：一场席卷海鸟种群的致命疫情
自2020年秋季至2023年，由H5Nx分支2.3.4.4b病毒引发的三次高致病性禽流感(HPAI)疫情在欧洲肆虐，导致数百万野生和家养鸟类死亡。在此期间，H5N1成为主要的禽流感病毒(AIV)亚型，并随着候鸟跨大陆传播，引发了一场动物大流行。其中，被称为EA-2022-BB的欧亚BB基因型(H5N1-A/Herring_gull/France/22P015977/2022-like)在2023年2月至10月期间成为主导，该基因型含有三个源自H13病毒的基因片段，可能促进了其在鸥类物种中的适应性。
2023年夏季，一场大规模死亡事件袭击了挪威北部瓦德瑟市Ekker?y的黑腿三趾鸥繁殖地。黑腿三趾鸥是一种长寿的海鸟，在北方和北极地区的陡峭悬崖上集群繁殖，被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录列为易危物种，在挪威红色名录中列为濒危物种。Ekker?y群落是挪威大陆上最大的群落，2012年估计有1.7万对繁殖个体。尽管先前在三趾鸥中检测到禽流感病毒和非H5亚型的抗体，但关于HPAI H5病毒在该物种中的发生、病理学或禽流感受体分布的知识有限，其对三趾鸥种群的影响此前 largely unknown。
疫情规模与影响评估
2023年5月，挪威哈斯塔德首次在死亡的三趾鸥中通过PCR检测到HPAI H5N1分支2.3.4.4b病毒，发生了一次较小的疫情。从5月1日到7月31日，提交给挪威兽医研究所(NVI)分析的40只死亡三趾鸥中，有32只检测出HPAI H5N1阳性，确认HPAI存在于特罗姆斯和芬马克郡的大多数繁殖地。
2023年7月28日至8月28日期间，在挪威北部的特罗姆斯和芬马克郡记录了24,594只野生鸟类尸体，主要是三趾鸥，这代表了一次重大的HPAI疫情。其中，15,235具尸体在Ekker?y三趾鸥群落所在的瓦德瑟市被收集。在Ekker?y群落附近地区，包括沿海水域、道路和屋顶，还观察到了大量额外的死亡三趾鸥，表明真实死亡数量更高。相比之下，根据群落数量统计，2023年Ekker?y的三趾鸥繁殖对估计为7,817对(15,634只)。考虑到未成熟个体和“浮游者”(即性成熟但不繁殖的鸟类)，Ekker?y 2023年的总种群可能多达3万只。因此，在报告了15,235只死亡鸟类并假设有大量未报告病例的情况下，HPAI很可能导致群落种群数量至少减少50%。
海鸟种群由于繁殖率低以及幼鸟在繁殖前需在海上生活多年，其增长缓慢。种群的急剧下降会严重影响其未来的生存状态，下降的种群很少能恢复，灭绝时间通常会缩短。因此，HPAI的爆发可能对受影响地区的三趾鸥种群产生 dramatic 的长期影响。
临床特征与病理发现
患病的黑腿三趾鸥表现出全身性嗜睡和严重的神经系统症状，包括平衡失调、颤抖、摔倒或转圈游泳。观察到的症状包括角弓反张(头后仰)、头部抽搐、斜视和单侧翅膀跛行，进而发展为瘫痪、轻瘫、卧地不起和死亡。
对10只近期死亡的三趾鸥(6只雌性，4只雄性，均为成鸟)进行尸检发现，所有鸟类的体腔和气囊中都有大量浆液性液体。观察到胰腺大面积坏死和出血、心外膜点状出血以及脾肿大。
组织病理学检查显示，所有10只鸟的大脑(包括大脑和小脑)均出现轻度至中度的组织病理学变化，表现为多灶性血管损伤、出血、神经纤维网空泡化以及多灶性坏死。这包括室管膜细胞、神经元和神经胶质细胞的单细胞变性和坏死，直至大面积坏死。两只鸟出现多灶性单核细胞性脑膜炎。除此之外，未观察到炎性细胞。所有鸟类的胰腺均出现多灶性出血和中度至重度、多灶性至弥漫性坏死。在肝脏中，除一只鸟外，其余均出现轻度至中度多灶性坏死。除一只鸟出现局灶性心内膜下出血外，心肌未观察到病理变化。肺、脾、前胃或肾脏未观察到特异性发现。未观察到细菌、寄生虫或真菌等病变内病原体。
病毒检测、定位与受体分布
通过免疫组织化学(IHC)对脑组织中的甲型流感病毒核蛋白(NP)进行染色显示，在坏死区域及其附近、大量单个神经元、胶质细胞和室管膜细胞中，以及较少数的脑膜和血管内皮细胞中，存在多灶性阳性标记。胰腺评估显示多灶性阳性信号，通常邻近坏死灶。在肝脏中，肝细胞以及窦状毛细血管和较大血管的内皮细胞中存在阳性信号。肺、脾或心肌中未检测到信号。
对选定鸟类的脑、胰腺、肝脏和脾脏组织进行RNA原位杂交(RNA-ISH)，显示出不同强度的信号，表明存在病毒RNA。标记在大脑、小脑和胰腺中很强，与IHC结果一致，但在血管内皮中更强、更广泛。肝脏的标记在不同个体间存在差异，从稀疏的点状信号到整个组织中肝细胞和内皮细胞的强烈、多灶性标记不等。检查了两只鸟的脾脏病毒RNA，一只显示多灶性弱阳性信号，另一只为阴性。
MAL-II凝集素染色标记了所有被检查的三趾鸥器官中血管内皮细胞的表面，表明存在作为禽流感病毒受体的α-2,3-连接的唾液酸(SA)。大脑中的标记稀疏，仅限于血管、室管膜和脑膜结构，但在神经元或胶质细胞中未观察到令人信服的信号。标记存在于前胃的粘液分泌上皮和肺上皮中。
病毒学调查与遗传特征
通过实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR)在所有个体的拭子和组织样本中检测到高病毒载量。检测到的平均水平最高(以定量周期Cq值表示)的是大脑(Cq 15.2)，其次是气管拭子(Cq 21.8)、泄殖腔拭子(Cq 23.6)、肝脏(Cq 24.8)和心脏(Cq 26.0)。
通过rRT-PCR和全基因组测序(WGS)，在所有10只鸟中均确认了具有血凝素(HA)裂解位点PLREKRRKR/GLF的HPAI H5N1分支2.3.4.4b病毒。全基因组测序未检测到与其他禽流感病毒亚型共感染的证据。GISAID BLASTn中的相似性搜索显示，来自Ekker?y三趾鸥的病毒与2023年春季和夏季在欧洲流行的同期BB基因型病毒具有99%–100%的同一性。系统发育分析表明，这些病毒聚集在一起，与2023年春季和夏季在挪威及欧洲其他鸥类中传播的病毒高度相似。
突变分析表明，在Ekker?y三趾鸥中检测到的病毒主要仍适应鸟类，具有BB基因型的典型特征，包括NP-Y52N和M2-A30S。未发现与哺乳动物适应性增加相关的HA或聚合酶蛋白关键替换。不存在与奥司他韦耐药相关的神经氨酸酶突变。
疫情管理与应对措施
疫情期间，市政当局组织了对尸体的清理和登记。处理鸟类的人员使用了 disposable 手套、防护服、护目镜和FFP3口罩。该区域安装了一个带有顶部投递口的密封容器，以便对鸟类尸体进行卫生安全的处理。尸检和样本采集后，剩余物被放入该容器。一旦装满，即被运至经认证的焚烧设施，以符合环境和生物安全法规。
与Ekker?y相比，邻近的瓦尔德市Horn?ya三趾鸥繁殖地观察到的死亡率较低。为防止干扰脆弱鸟类并进一步传播病毒，于2023年7月27日优先对Horn?ya和另外两个自然保护区实施了行动限制。在Ekker?y，张贴了告示，提供有关疫情的信息并劝阻该区域的交通。该地区的牲畜放牧未受到限制。
讨论：病理机制、传播与长期影响
本研究记录了HPAI H5N1导致的三趾鸥大规模死亡，并增进了对该物种疾病、病理学和禽流感病毒受体分布的理解。感染三趾鸥的临床症状表明疾病主要影响中枢神经系统(CNS)，这与病毒的嗜神经性一致。
在感染HPAIV的鸥类中，一个常见的病理学发现是伴有淋巴细胞性浆细胞性脑炎和胶质增生区域的亚急性疾病。这与我们的发现不同，死亡的三趾鸥在大脑、胰腺和肝脏表现出广泛的坏死，没有或仅有有限的炎症迹象。这可能表明HPAI H5N1基因型BB感染通过血源性传播，在死亡前没有足够时间发生炎症反应，将其定义为三趾鸥的一种急性、高致病性、全身性和致命性疾病。一项实验性研究用HPAI H5N1病毒接种鸭子和野生笑鸥，在死亡或因病重而被安乐死的鸟类大脑和胰腺中产生了坏死，这与我们在三趾鸥中的发现相符。由于我们的研究只包括死亡鸟类，我们不知道是否有受感染鸟类从感染中恢复，以及这些鸟类是否会呈现类似的亚急性炎症病变。
与HPAI的标志性特征一致，三趾鸥表现出 widespread 全身性感染迹象，除了气管和泄殖腔外，在大脑、肝脏和心脏也检测到HPAI H5N1病毒RNA。到死亡时，在大脑中检测到最高的病毒水平，这得到了低Cq值以及广泛的IHC和RNA-ISH标记的支持。这与该器官中最明显的组织病理学病变相符。除了广泛的组织病理学病变外，广泛的IHC和RNAscope标记也表明胰腺中的病毒水平很高。我们未对胰腺样本进行rRT-PCR。然而，基于该器官的广泛病理变化，我们建议在未来的研究中纳入胰腺样本的rRT-PCR。
病毒与细胞的附着是决定病毒嗜性的关键因素，禽流感病毒HA优先结合α2,3-连接的唾液酸。HPAIV在内皮细胞中的复制在鸡和天鹅中很常见，但在鸭子和哺乳动物中较少。有趣的是，在三趾鸥的血管内皮细胞中显著检测到α2,3-连接的唾液酸。在大脑和胰腺中观察到伴有出血的血管损伤以及病毒RNA和抗原的内皮表达。这表明三趾鸥的内皮细胞对HPAIV易感，支持了血源性传播的假说。
尽管大脑中甲型流感病毒RNA和NP表达强烈，但神经元未被MAL-II标记，这表明H5N1靶向的神经元细胞类型结构与MAL-II结合位点(Sia-α2,3-Galβ1-GalNAc)不重叠。神经节苷脂是中枢神经系统中α2,3-和α2,6-连接的唾液酸的主要载体，并支持不同甲型流感病毒毒株的附着。与先前在银鸥、笑鸥和环嘴鸥中的观察类似，三趾鸥前胃的粘液分泌上皮和肺上皮表达了MAL-II靶向的唾液酸。
在Ekker?y三趾鸥中检测到的HPAI H5N1病毒与2023年春季在欧洲传播的BB基因型病毒之间的遗传相似性表明，病毒是由来自欧洲的候鸟引入挪威北部的繁殖地。三趾鸥中的病毒彼此高度相似，并与在挪威其他鸥类物种中检测到的BB基因型病毒聚集在一起，表明Ekker?y的疫情是更大规模动物流行病的一部分。挪威北部阳性病例的时间顺序支持病毒从西南向东北逐渐移动。我们不能排除病毒在三趾鸥在大西洋远洋阶段与其他海鸟混合时传入的可能性。然而，我们没有发现数据支持这一点，而且这种传入将需要更长的感染无症状期。2023年7月在芬兰检测到的两例三趾鸥HPAIV与来自挪威北部的鸥类病毒聚集在一起，表明来源相同。2023年7月来自挪威南部的另一个病毒与2023年夏季在丹麦、英格兰和苏格兰的鸥类中检测到的HPAI H5N1病毒聚集在一起，可能代表了来自北海地区的 separate introduction。
由于一致的临床症状、病理学发现以及在所有被检查鸟类中检测到高水平的HPAI H5N1感染，加上没有病变内感染因子(如细菌)和炎症，在此次疫情中未进行广泛的鉴别诊断工作。值得注意的是，全基因组测序未发现混合禽流感病毒感染的任何证据。
三趾鸥的死亡率在不同群落之间差异很大，例如Ekker?y和Horn?ya之间。2022年夏季，德国瓦登海地区的燕鸥群落也出现了类似模式，一些地点死亡率高达40%，而其他地点则大多幸免。影响死亡数量的因素包括宿主易感性、群落规模、物种多样性、行为变化、鸟类移动模式、免疫状态、病毒引入的时间和规模、环境因素以及不同的记录方式。了解群落内和群落间的传播需要对所有相互作用的物种进行野生动物群落监测。
有几个因素可能导致三趾鸥中HPAI疫情的严重性。由于三趾鸥的远洋生活方式，假设在2023年动物流行病之前对H5的 preexisting immunity 较低。病毒特性，特别是BB基因型的遗传组成，也可能增强了病毒在鸥类中的复制。三趾鸥巢穴紧密相邻，便于病毒传播。Ekker?y的疫情爆发恰逢大量易感雏鸟和成年鸟在繁殖期结束时身体状况下降，这可能降低了它们对感染的抵抗力和恢复力。在Ekker?y附近的Storelva河，大量受感染的尸体、羽毛和粪便 combined with 低水位 likely promoted 病毒通过淡水传播。环境样本本可以提供更多信息，应在未来的疫情中获取。
在Ekker?y三趾鸥中检测到的病毒是适应鸟类的，其突变谱与其他BB基因型病毒相似，因此未表明哺乳动物适应性风险增加。然而，存在少数可能增加人畜共患风险的突变。鉴定出了与逃避人类BTN3A3限制相关的NP-Y52N。
结论与建议：一体化健康应对
我们可以实施缓解措施来减少HPAI传播并保护脆弱的野生鸟类种群。其中一项措施是清除尸体，但这必须与干扰群落中剩余鸟类的风险相平衡。清除尸体的效果难以衡量。一项对受HPAI影响的 sandwich 燕鸥群落的研究发现，清除尸体使成年鸟死亡率平均降低15%。为保持环境中的感染压力较低并减少向其他鸟类和哺乳动物的溢出，应在疫情早期由训练有素的人员使用个人防护装备开始清除尸体。瓦德瑟只有5800名居民，海岸线长， livestock 养殖极少。Ekker?y大量的鸟类尸体由于这个偏远地区人员 limited，又恰逢夏季假期，处理起来具有挑战性，这突显了在极端情况下需要 joint effort。
在极端情况下，可考虑对濒危鸟类物种进行 vaccination 作为保护性措施。然而，对于三趾鸥，由于它们的摄食行为，口服或诱饵式投递不可行，而在大型海鸟群落中进行肌肉注射在 logistics 上具有挑战性。此外， vaccine 功效可能因物种和流行病毒毒株而异。
早期发现具有 increased 感染哺乳动物能力的病毒对于大流行防范至关重要。因此，管理野生动物中的HPAI大规模死亡需要具有明确定义组织角色的多部门“一体化健康”方法。在2023年疫情期间，未进行 active 的跨物种监测以检测 potential 的病毒溢出，但建议在未来的野生动物疫情中开展，主要 focus 于食腐动物、捕食者和海洋哺乳动物。对禽流感的 passive 监测 ongoing 但该地区样本 limited，一些野生动物病例可能未被发现。在疫情期间，在Ekker?y观察到了白尾海雕。然而，未发现疾病或死亡，表明它们对BB基因型的易感性较低。在2024年3月从美国得知反刍动物可感染HPAIV后，我们对在病态和死亡三趾鸥中放牧的羊进行了 post-outbreak 监测。在疫情发生11个月后，在一只羊中检测到H5抗体，表明向哺乳动物的病毒溢出rare 发生。对人员 follow up 则根据当时挪威公共卫生研究所推荐的 existing 程序。这些 guidelines 指出，市政医生应考虑在暴露后提供奥司他韦的暴露后预防，并建议在暴露后14天内出现临床症状时进行PCR检测。与此次疫情有关的此类有临床症状的病例未有报告。当时无法进行血清学检测。
我们的研究并未确定三趾鸥在多大程度上能从感染中存活并可能获得免疫力。能提供此类数据的研究对于预测该种群及其他三趾鸥种群对未来HPAI H5Nx疫情的脆弱性可能具有重要价值。
我们建议进一步监测HPAI对三趾鸥种群的长期影响。海鸟繁殖地的HPAI疫情需要引起重视，并应采用多部门的“一体化健康”方法进行缓解，以保护濒危野生动物物种、哺乳动物和公共卫生。
