反义抑制C4植物二齿黄菊NADP-ME活性改变气孔对胞间CO2浓度的敏感性研究

《New Phytologist》：Antisense reduction in NADP-ME in the C4 species Flaveria bidentis alters stomatal sensitivity to intercellular [CO2]

本研究通过反义技术靶向C4植物二齿黄菊（Flaveria bidentis）的关键脱羧酶——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸苹果酸酶（NADP-ME），揭示了碳同化途径的扰动如何影响气孔调控。研究发现在环境CO2下，尽管反义植株的气孔导度（gs）未变，但其胞间CO2浓度（Ci）显著升高。当在恒定Ci条件下测量时，反义株系表现出更高的gs。这些结果表明，C4循环的破坏改变了气孔对Ci信号的敏感性，为理解光合作用与气孔行为的协调机制提供了新视角。

　　

引言

气孔是叶片表皮上的微孔，通过调节其开度来平衡光合作用所需的CO₂摄取与蒸腾作用造成的水分流失。气孔开度的调整主要依赖于保卫细胞的膨压变化，并受到环境与内部信号（如光照、湿度、温度、干旱以及胞间CO₂浓度）的动态调控。其中，叶片内部的CO₂浓度是调控气孔开闭的关键信号之一。传统观点认为，保卫细胞主要响应胞间CO₂浓度的变化，但近年的研究表明，叶肉细胞来源的可扩散代谢物等信号也参与其中，形成了依赖于C_i和不依赖于C_i的两种调控途径。

在C₃植物中，通过转基因技术降低卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环关键酶（如Rubisco、磷酸核酮糖激酶等）的活性，可以严重削弱光合能力，但气孔导度却往往变化不大。这些研究表明，光合作用与气孔导度之间的紧密协调在某些情况下可以被解耦。然而，先前许多研究在测量气孔导度时，通常未等到气孔反应完全稳定，也未充分考虑因光合能力下降导致C_i升高等混杂因素的间接影响，这使得对气孔响应的解释变得复杂。

C₄植物因其独特的碳浓缩机制，为研究碳同化对气孔调控的影响提供了理想的实验体系。在C₄植物中，净CO₂同化速率在正常条件下接近CO₂饱和状态。因此，通过改变外界CO₂或C_i来研究气孔导度变化时，可以避免同时影响净同化速率所带来的混杂效应。此外，通过扰动C₄循环活性来调整碳吸收通量，不会像许多卡尔文循环突变体那样直接影响保卫细胞的光合作用。基于这些原因，C₄循环酶的突变体能够规避一些常见干扰，从而更清晰地验证叶肉碳通量的变化是否通过依赖C_i或不依赖C_i的机制来改变气孔行为。

材料与方法

本研究使用的材料为野生型和转反义NADP-ME基因的二齿黄菊（Flaveria bidentis (L.)）T₁代种子。反义构建体靶向的是叶绿体C₄型NADP-ME亚型ChlME1的中央编码区。通过自交获得了T₂代纯合植株，所有类型分析均在T₃代纯合系的8周龄植株上进行。

通过蛋白质免疫印迹确认了NADP-ME蛋白含量的降低。使用分光光度法测定了NADP-ME、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和Rubisco的最大酶活性。同时测定了叶片总叶绿素含量和总可溶性蛋白含量。

气体交换测量使用LI-6400XT光合仪在8周龄植株最新完全展开的叶片上进行。实验设计包括：评估气孔对不同红蓝光比例组成的响应；以及遵循Messinger等人描述的实验方案，在恒定C_i的条件下，测量气孔导度对不同红光强度的响应。所有测量均在参考CO₂为400 μmol mol^-1、叶室温度为25°C、平均蒸汽压亏缺约为1.2 kPa的条件下进行。

使用指甲油印迹法获取叶片上下表皮的气孔印记，并通过显微镜成像和图像分析软件测量气孔密度和大小。所有数据均使用R语言中的线性混合效应模型进行统计分析。

结果

NADP-ME活性在纯合反义植株中显著降低

蛋白质免疫印迹分析证实，与野生型相比，三个独立的反义株系（1A-5, 1A-8, 2A-1）的NADP-ME蛋白条带明显减弱。酶活性测定显示，反义株系叶片总NADP-ME活性显著降低，平均为12.4 ± 0.9 μmol m^-2s^-1，而野生型为39.3 ± 2.7 μmol m^-2s^-1，降幅约为68%。

NADP-ME活性降低对其他关键碳同化酶影响不显著

尽管基因型对PEPC活性有显著影响，但只有株系1A-5与野生型存在显著差异。Rubisco活性、Rubisco活化状态以及PEPC与Rubisco的活性比值均未显示出显著的基因型效应。总叶绿素含量和总可溶性蛋白含量也未受反义构建体的显著影响。

反义株系在环境CO₂下的操作胞间CO₂浓度显著升高

在100%红光或75%红光/25%蓝光条件下，无论基因型如何，蓝光对气孔开度均无显著影响。在整个实验过程中，基因型对气孔导度的整体平均值也无显著影响。然而，对C_i的分析显示出显著的基因型效应，反义株系的C_i值显著高于野生型对照。

在恒定C_i下测量时，反义株系的气孔导度显著增加

为了排除反义株系升高的C_i可能抑制其气孔导度这一混杂因素，研究者在恒定C_i条件下（设定为野生型植株的操作浓度120 μmol CO₂mol^-1）进行了后续实验。当入射红光强度从800降低到200 μmol photons m^-2s^-1时，反义株系的整体气孔导度没有变化，而野生型的气孔导度虽然也保持恒定，但数值显著低于所有反义株系。统计分析表明，基因型对气孔导度的影响是显著的，三个反义株系的气孔导度值均显著高于野生型。净CO₂同化速率对所有基因型中的红光强度均有显著响应，但基因型与光照水平之间的交互作用不显著，表明尽管基础同化能力不同，反义和野生型植株对增强的红光响应相似。

气孔密度和大小在反义株系中略有改变

与先前在野生型二齿黄菊中的观察一致，气孔密度在叶片两面存在差异，下表皮的气孔密度和大小高于上表皮。在NADP-ME反义株系中，气孔密度相对于野生型略有降低，尤其是在上表皮；而下表皮的气孔大小在两个反义株系（1A-5和1A-8）中略有增加。然而，这些微小的差异似乎与观察到的气孔导度增加并不一致，气孔导度的增加更可能是气孔开度对CO₂敏感性改变的结果。

讨论

本研究探讨了在C₄物种二齿黄菊中反义降低主要C₄酸脱羧酶NADP-ME活性对气孔导度的影响。C₄循环的扰动为研究碳同化受损植株中光合作用与气孔导度的协调提供了一种手段，且不直接靶向CBB循环中的酶。反义抑制使NADP-ME活性降低了66-73%，但仅使光饱和净CO₂同化率中度下降了17%至35%。尽管净同化率显著降低，但并未观察到相应的气孔导度下降。

光合作用通过降低叶片内的C_i来影响气孔开度，这在文献中被称为依赖C_i的气孔红光响应。当通过在野生型植株的C_i下进行评估，从而消除了光合作用下降对气孔导度的负面影响时，NADP-ME反义植株表现出显著更高的气孔导度。这显示了在解释气孔响应时，考虑反义构建体对操作C_i影响的重要性。

在C₃和C₄系统中，先前针对光合酶的研究都表明，即使同化率大幅下降，气孔响应也可能出人意料地缺乏。这些研究共同突显了在某些光合酶的遗传操作下，气孔调控可以与光合能力解耦。如果不加以考虑，由CO₂同化能力降低（或增强）引起的C_i任何升高（或降低），都可能导致任何光合作用改变的转基因株系中气孔开度的抑制（或增强）。如本研究所示，通过在恒定浓度下测量以消除C_i的混杂效应后，揭示了反义植株中气孔导度的显著增加，而这一现象曾被相反的C_i效应所掩盖。

在气体交换测量期间保持C_i恒定虽然耗时，但方法相对简单，需要通过仪器的CO₂控制设置迭代调整C_a以控制C_i。然而，通过C_a控制C_i意味着要保持C_i恒定，C_a必须变化，因此，如果保卫细胞能够感知C_a，则可能混淆气孔响应。自Mott的开创性工作以来，共识是保卫细胞专门感知C_i。然而，考虑到C_i/C_a升高是大多数CBB循环或C₄循环受损的转基因植物的普遍特征，即使气孔孔道中的CO₂有中等程度的贡献，保卫细胞感知到的平均CO₂浓度也可能升高，从而抑制气孔开放。基于这种感知浓度的升高，实验还应考虑气孔密度对高CO₂的潜在适应性下降。

本研究中C₄循环突变体的观察结果证实了先前几项关于CBB循环突变体的研究，表明CBB循环或C₄循环酶表达的降低对CO₂同化的负面影响本身与气孔功能无关。事实上，在未受扰动的植物中观察到的明显协调并不反映光合作用与气孔导度之间的直接联系。尽管如此，光合作用通过其对C_i的影响来影响气孔导度，这通常应导致具有较高C_i的遗传突变植株气孔导度下降。这一现象往往未被观察到，可能意味着这些突变体中普遍存在的气孔导度并非由碳收益相对于水分损失的最优化决定，而是反映了气孔对主要生长条件的适应，以支持蒸腾作用的替代功能，例如驱动养分吸收和转运的整体水分运动。这可以通过调整气孔大小和分布来实现，但在本研究中并非如此。相反，反义植物在相同C_i下比野生型植物张开更多，但在“生长C_i”下则不然，这一事实表明，这种适应可能涉及感知和高C_i下保卫细胞膨压响应的分子参与者的调整。这些可能包括β-碳酸酐酶1和4、HIGH LEAF TEMPERATURE 1蛋白激酶、RESISTANT TO HIGH CO2 MATE型转运蛋白以及丝裂原活化蛋白激酶MPK4和MPK12。表达或翻译后修饰的微小适应性调整可能导致了观察到的表型。

另一种假设可能是保卫细胞苹果酸库受到了反义构建体的影响。苹果酸作为钾积累的反离子参与气孔开放以平衡电荷。先前对C₄物种Amaranthus edulis的研究表明，将PEPC强烈反义降低至野生型水平的3%会导致气孔开放变慢和稳态导度降低，这被认为是由于保卫细胞中苹果酸形成更慢且含量更低。根据最近的单核和单细胞RNA测序数据，虽然反义构建体是针对C₄型NADP-ME亚型设计的，但其与保卫细胞中表达的主要叶绿体亚型具有89.9%的序列保守性。因此，本研究中使用的NADP-ME反义构建体也可能降低了保卫细胞中的NADP-ME活性。如果是这样，由此产生的保卫细胞苹果酸代谢改变可能会以与Cousins等人观察到的PEPC反义效应相反的方式影响气孔导度。在气孔关闭期间，苹果酸被NADP-ME脱羧为丙酮酸，然后在线粒体三羧酸循环中完全氧化。或者，苹果酸可以通过NAD⁺依赖性苹果酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的联合作用转化为PEP。因此，如果反义株系中保卫细胞的NADP-ME活性降低，气孔开放期间积累的苹果酸可能无法被迅速代谢，这可能导致气孔开放增加和气孔关闭变慢，这与在相同C_i下观察到的更高的气孔导度一致。

结论

本研究重点关注了C₄循环破坏对气孔导度调控的影响。结果表明，在相同C_a下，C₄二齿黄菊的NADP-ME反义株系具有与野生型相似的气孔导度，但操作C_i更高；而在相同C_i下的测量显示反义株系的气孔导度增加。这些发现最符合反义株系中保卫细胞C_i敏感性发生改变的结论。我们推测，保卫细胞中CO₂感知的改变可能为在相同C_i下气孔导度的增加提供了分子解释。