《Journal of Advanced Research》：Temporal variability of urinary microcystin-LR concentrations in healthy adult men: Recommendations for sampling strategy
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本研究针对评估人体微囊藻毒素-LR暴露水平时，因单次尿液样本高变异性易导致误分类的问题，通过连续多日采集20名健康男性在冷、暖季节的即时尿、晨尿和24小时尿样本，采用UPLC-MS/MS测定MC-LR，评估了其时间变异性。研究发现尿MC-LR浓度存在显著的个体内变异，单次尿液样本预测长期暴露的准确性有限，而收集2份及以上样本可显著提高评估准确性，为未来流行病学研究提供了优化的尿液采样策略依据。
在湖泊、水库等水体富营养化日益严重的背景下，蓝藻爆发产生的次级代谢产物——微囊藻毒素(Microcystins, MCs)成为了一个不容忽视的公共健康威胁。其中，微囊藻毒素-LR (MC-LR)因其毒性强、分布广，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为2B类致癌物。人们通过饮水、食物链等多种途径摄入MC-LR，已有研究表明它在人体血液、精液等生物样本中被检出，并与肝损伤、代谢紊乱及精子质量下降等多种不良健康结局相关。然而，在评估人体实际暴露水平时，科学家们面临一个棘手的问题：外部环境监测难以准确反映个体内的累积暴露，而常用的生物样本（如血液）采集具有侵入性。尿液作为一种无创、易得的样本，理论上具有用于生物监测的潜力。但一个核心的科学疑问悬而未决：尿液中的MC-LR浓度是否稳定？单次的一次尿或晨尿检测，能否可靠地代表一个人长期的MC-LR平均暴露水平？如果答案是否定的，那么为了准确评估暴露，我们需要采集多少份、什么类型的尿液样本？这正是发表在《Journal of Advanced Research》上的一篇题为《健康成人男性尿液中微囊藻毒素-LR浓度的时间变异性：采样策略建议》的研究试图回答的问题。
为了探究上述问题，研究人员设计了一项严谨的纵向研究。他们招募了20名22至31岁的健康成年男性志愿者（排除了女性以避免月经周期带来的生理变异性干扰），在2022年9月（暖季）和2023年2月（冷季）分别连续5天收集了所有即时尿（又称随机尿）、晨起第一次尿(FMV)并合算当天的24小时尿。研究期间共收集了1012份即时尿样本（含200份晨尿）。所有样本使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术测定MC-LR原型浓度，同时测定尿肌酐(Cr)用于浓度校正。通过计算组内相关系数(ICCs)评估重复测量的可重复性，并使用敏感性、特异性分析以及计算所需最少样本数(k)等方法，系统评估了不同采样策略在识别高暴露个体和估计个体长期平均暴露水平方面的准确性。
研究结果
1. 尿液中MC-LR浓度的分布
在所有1012份尿样中，MC-LR的检出率为66.12%，表明普通人群普遍暴露于微囊藻毒素。浓度范围为低于检测限至4.2285 μg/L。无论是即时尿、晨尿还是24小时尿，冷季的MC-LR中位浓度均显著高于暖季。对不同尿液稀释校正方法（未校正、肌酐校正、肌酐作为协变量、尿排泄率校正）的模型拟合比较显示，肌酐校正模型的赤池信息量准则(AIC)值最小，拟合最优，因此在后续分析中采用肌酐校正浓度(μg/g Cr)。
2. 即时尿、晨尿和24小时尿MC-LR浓度的个体内与个体间时间变异性
通过混合线性模型和ICCs分析发现，无论是全年、暖季还是冷季，即时尿、晨尿和24小时尿MC-LR浓度的ICCs均小于0.40，表明其重复测量的一致性差，可重复性低。进一步分解方差发现，在即时尿中，个体内日间变异和个体内日内变异构成了总变异的主要部分（全年分别占22%和75%），而个体间变异仅占很小比例（全年3%）。在暖季，即时尿的个体内变异（日间3%，日内82%）也远大于个体间变异（15%）；在冷季，个体内日内变异更是占到了总变异的98%。对于晨尿和24小时尿，其变异也主要由个体内日间变异主导。这些结果表明，尿MC-LR浓度存在巨大的个体内时间变异性，且个体间差异相对较小。
3. 即时尿MC-LR浓度的日内变异
研究人员还将一天中的采样时间分为上午、下午和晚上，以评估不同时段的变异情况。结果显示，各时段尿MC-LR浓度的ICCs仍低于0.40，可重复性低。且在所有时段，个体内日内变异都是总变异的最主要来源。这表明，仅改变单次尿样的采集时间（如固定采集晨尿），对改善尿MC-LR浓度测量可重复性的作用有限。
4. 即时尿或晨尿与同日24小时尿MC-LR浓度的相关性
尽管存在高变异，混合线性模型和皮尔逊相关分析均显示，无论是全年还是分季节，即时尿和晨尿的MC-LR浓度均与同日24小时尿浓度呈显著正相关。就预测24小时尿浓度的准确性而言，全年来看，晨尿稍优于即时尿；分季节看，暖季即时尿和晨尿的预测准确性相近且较低，而冷季晨尿的预测准确性则明显提高。
5. 单次及多次尿样识别高暴露个体的敏感性与特异性
研究人员模拟流行病学抽样，评估了随机抽取1次、2次和3次尿样（即时尿或晨尿），用于判别个体长期平均MC-LR浓度是否属于高暴露组（前33%）的能力。结果显示，无论是全年还是分季节，单次尿样的敏感性（正确识别高暴露者的能力）相对较低（全年即时尿为0.50，晨尿为0.57）。增加样本数量能显著提高敏感性，例如收集3次即时尿样本可使全年敏感性升至0.67。特异性（正确识别非高暴露者的能力）通常高于敏感性。此外，研究计算出，若要以95%的概率将个体特异性均值估计在“真实”值的20%范围内，在暖季至少需要3份尿样，在冷季则需要18份，全年则需要9份。
研究结论与讨论
本研究首次系统揭示了健康成人男性尿液中MC-LR浓度存在显著的个体内时间变异性，且这种变异远大于个体间差异。无论采集即时尿、晨尿还是24小时尿，MC-LR浓度的测量在短期和长期内均表现出较差的可重复性。这意味着，仅凭单次尿液样本很难准确评估个体的长期平均MC-LR暴露水平，极易导致暴露误分类，从而影响后续健康效应研究的准确性。
研究的重要发现在于，尽管改变单次采样的时间点（如固定采集晨尿）对改善结果重现性帮助有限，但通过增加采样次数可以显著提升暴露评估的准确性。敏感性分析表明，收集2份或3份尿液样本能更可靠地识别高暴露个体。肌酐校正被证明是用于尿MC-LR分析的一种较优的浓度校正方法。这些发现为未来开展MC-LR相关的流行病学研究提供了关键的生物样本采集策略指导：为了更准确地评估人群的MC-LR暴露水平，研究者应考虑在多个时间点（最好跨越不同季节）收集每位参与者的至少2份尿液样本，而非依赖于单次检测。
该研究也存在一些局限性，如研究对象均为同质化的年轻健康男性，限制了结论向女性、儿童等群体的外推；缺乏与每次尿液样本同步的详细饮食记录，无法将短期浓度波动归因于特定饮食摄入；采样集中在两个5天时段，可能未能完全反映全年的暴露模式。未来的研究需要在更广泛的人群中，结合更全面的暴露信息，进行更长期的采样设计，以进一步验证和优化针对MC-LR及其他环境毒素的尿液生物监测策略。
