《Journal of Advanced Research》：Pachymic acid targets PDIA6 to delay mesenchymal stem cell senescence through the G6PD/STAT3 signaling axis and prevent senile osteoporosis
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为解决干细胞衰老导致再生能力下降、驱动衰老及相关疾病（如老年性骨质疏松）的问题，研究人员以传统中药茯苓（Poria cocos）中的三萜类化合物——茯苓酸（Pachymic acid, PA）为研究对象，通过建立氧化应激诱导的间充质干细胞（MSC）衰老模型，结合化学蛋白质组学、分子对接、动物实验等技术，揭示了PA通过特异性靶向蛋白二硫键异构酶A6（PDIA6），解除其对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的抑制，进而激活G6PD/STAT3信号轴，从而延缓MSC衰老、改善老年性骨质疏松的作用机制。该研究不仅为开发抗衰老及老年性骨质疏松的新药提供了科学依据，也验证了基于干细胞衰老模型筛选抗衰老化合物的可行性，具有重要的理论意义与临床应用前景。
随着全球人口老龄化加剧，衰老及其相关疾病（如癌症、心血管疾病、退行性疾病等）已成为公共卫生领域的重大挑战。衰老的本质是机体功能随时间的进行性衰退，其中，干细胞（特别是成体干细胞）的衰老及随之而来的衰竭，被认为是组织再生能力下降、驱动机体衰老的关键因素之一。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）作为存在于几乎所有组织中的主要成体干细胞类型，具有自我更新、多向分化、免疫调节和再生修复的潜能，其衰老与多种年龄相关疾病的发生发展密切相关。因此，靶向干细胞衰老、促进其“年轻化”，被视为对抗衰老和年龄相关疾病的一种有前景的策略。然而，目前能够通过靶向干细胞来延缓衰老、治疗年龄相关疾病的药物干预手段仍非常有限。
另一方面，传统中药（Traditional Chinese Medicine, TCM）在对抗衰老和年龄相关疾病方面展现出多成分、多靶点、多通路的潜力，是发现新型抗衰老药物的重要资源。茯苓（Poria cocos）作为著名的传统中药，已有两千多年的应用历史，以其促进健康、延年益寿的功效而闻名。茯苓含有多种化学成分，其中三萜类化合物和多糖是其主要活性成分。尽管茯苓多糖已被证明在果蝇模型中具有延缓衰老的作用，但其三萜类化合物的抗衰老特性及其机制尚不明确。
在此背景下，研究人员提出了一个核心问题：能否从茯苓的三萜类化合物中，筛选出能够有效延缓干细胞衰老的活性成分？如果存在这样的成分，其作用的分子靶点和信号通路是什么？更重要的是，它能否在体内对抗由干细胞衰老驱动的年龄相关疾病，例如老年性骨质疏松（Senile Osteoporosis, SOP）？
为了回答这些问题，研究团队在《Journal of Advanced Research》上发表了一项系统性研究。他们首先建立了一个氧化应激（使用H2O2处理）诱导的人间充质干细胞（hMSC）衰老模型，并利用该模型对茯苓的三萜类成分进行筛选。结果发现，茯苓酸（Pachymic acid, PA）表现出了显著的抗衰老潜力。
在技术方法层面，本研究综合运用了多种关键技术：1) 利用从健康孕妇胎盘羊膜组织分离并鉴定的人间充质干细胞（hMSC），构建H2O2诱导的衰老模型；2) 采用药物亲和响应靶稳定性（Drug Affinity Responsive Target Stability, DARTS）技术和化学蛋白质组学（液相色谱-串联质谱，LC-MS/MS）来鉴定PA的潜在作用靶点；3) 通过细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）、分子对接、定点突变、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）等技术验证靶点相互作用及关键结合位点；4) 利用基因敲低（shRNA）和过表达技术在细胞水平验证靶点功能；5) 使用自发衰老的SAMP6小鼠作为老年性骨质疏松模型，通过灌胃给药进行体内药效评价，并结合micro-CT扫描、组织病理学分析、酶联免疫吸附测定（ELISA）及从模型小鼠骨髓中分离的骨髓间充质干细胞（BMSC）功能检测，评估PA的体内抗衰老及抗骨质疏松效果。
研究结果
1. PA在体外显著延缓hMSC衰老
研究人员发现，PA处理能显著逆转衰老hMSC的细胞周期停滞（特别是G2/M期），减少活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累，降低衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性细胞比例及衰老标志物p21和p16的蛋白表达。同时，PA增强了hMSC的自我更新能力（表现为集落形成增加）、上调了多能性因子（OCT4, Nanog, SOX2）的表达，并恢复了其向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。这些结果表明PA对氧化应激诱导的hMSC衰老具有显著的保护作用。
2. PA通过激活JAK2/STAT3通路延缓hMSC衰老
分子机制探索发现，PA处理上调了JAK2和STAT3的mRNA及磷酸化蛋白水平。当使用JAK2/STAT3通路特异性抑制剂AG490阻断该通路后，PA的抗衰老效应被显著削弱，表现为SA-β-Gal阳性率回升、ROS积累增加、集落形成及多能性因子表达下降。这证实了JAK2/STAT3通路的激活是PA发挥抗衰老作用的重要机制。
3. PA特异性靶向PDIA6，通过解除其对G6PD的抑制来激活STAT3
为了寻找PA的直接作用靶点，研究团队通过DARTS结合LC-MS/MS分析，将蛋白二硫键异构酶家族A成员6（Protein Disulfide Isomerase Family A Member 6, PDIA6）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase, G6PD）鉴定为候选靶点。进一步的验证（DARTS、CETSA）表明，PA能直接与PDIA6结合，增加其酶解和热稳定性，但与G6PD无直接结合。功能实验显示，PA处理或敲低PDIA6均能上调G6PD蛋白表达；而过表达PDIA6则会抑制G6PD表达并加剧细胞衰老表型，此效应可被PA逆转。虽然PDIA6与G6PD之间未检测到直接物理相互作用，但PDIA6对G6PD表达具有负向调控作用。重要的是，敲低G6PD或过表达PDIA6都会降低STAT3的磷酸化水平，而不影响JAK2的磷酸化。这表明PA是通过靶向PDIA6，解除其对G6PD的抑制，进而特异性激活STAT3（而非JAK2）来发挥抗衰老作用。进一步的分子对接和定点突变实验确定，PA通过与PDIA6蛋白的第221位天冬氨酸（D221）和第166位苏氨酸（T166）残基结合来实现其功能。
4. PA通过延缓BMSC衰老改善老年性骨质疏松小鼠的骨表型
在体内实验中，研究人员使用自发衰老且易患骨质疏松的SAMP6小鼠模型。口服给予PA（10, 30, 60 mg/kg）四周后，小鼠血清中的衰老生物标志物（如晚期糖基化终末产物AGE、丙二醛MDA）水平下降，睾酮水平上升。同时，骨形成标志物（如骨钙素BGP、I型前胶原氨基端前肽P1NP）升高，而骨吸收标志物（如抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP、I型胶原C端肽CTX1）降低。micro-CT扫描和组织学分析显示，PA治疗显著改善了SAMP6小鼠的骨微结构，增加了骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th），减少了骨小梁分离度（Tb.Sp）。此外，PA未引起明显的肝肾功能损伤。
5. PA在体内通过相同的PDIA6/G6PD/STAT3轴延缓BMSC衰老
从PA治疗后的SAMP6小鼠骨髓中分离出的BMSC表现出衰老表型的逆转：细胞周期停滞缓解、活力增强、ROS积累和SA-β-Gal阳性率降低、成骨和成软骨分化能力恢复。蛋白水平分析证实，PA处理上调了BMSC中G6PD和磷酸化STAT3的表达，而对PDIA6表达无影响，这与体外hMSC中的发现一致。这强有力地表明，PA在体内通过保守的PDIA6/G6PD/STAT3信号轴延缓BMSC衰老，从而改善老年性骨质疏松。
结论与讨论
本研究系统性地阐明了茯苓酸（PA）作为一种新型抗衰老候选化合物的作用机制和体内功效。核心结论是：PA特异性靶向PDIA6蛋白的D221和T166残基，通过解除PDIA6对G6PD的抑制作用，激活下游的G6PD/STAT3信号轴，从而在细胞水平上延缓人间充质干细胞（hMSC）的衰老。在动物水平上，PA通过相同的信号轴延缓老年性骨质疏松（SOP）模型小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的衰老，有效改善了骨的衰老表型，包括促进骨形成、抑制骨吸收、改善骨微结构和增加骨量。
这项研究的意义重大。首先，它从传统中药茯苓中成功发现并验证了一个具有明确抗干细胞衰老活性的小分子化合物PA，为抗衰老药物研发提供了新的候选物质。其次，研究首次揭示了PDIA6在调控干细胞衰老中的新功能，以及PA通过PDIA6-G6PD-STAT3这一先前未被认识的信号轴发挥作用的分子机制，丰富了我们对衰老调控网络的理解。第三，研究不仅停留在细胞层面，更重要的是在生理相关的老年性骨质疏松疾病模型中验证了PA的治疗效果，完成了从靶点发现、机制阐释到体内药效验证的完整转化医学研究链条，为开发治疗老年性骨质疏松等年龄相关疾病的新药奠定了坚实的科学基础。最后，该研究也验证了基于干细胞衰老模型筛选抗衰老化合物的策略的可行性和有效性，为未来从天然产物或化合物库中挖掘更多抗衰老药物提供了方法学借鉴。
当然，研究也存在一些局限性，例如PA相对于临床现有抗骨质疏松药物（如双膦酸盐）的疗效对比尚未进行，PDIA6调控G6PD的具体中间分子尚未明确，以及PA激活JAK2的独立通路有待进一步探索。这些都为未来的深入研究指明了方向。总体而言，这项研究为通过靶向干细胞衰老来对抗机体衰老及相关疾病提供了一个出色的范例，具有重要的理论创新价值和临床转化潜力。
