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这篇研究性文章（非综述）创新性地构建了一种基于叶脉仿生的微流控芯片（bone-on-leaf-chip），用于模拟肺癌骨转移的复杂过程。文章核心在于利用该芯片平台，在体外重现了两种不同的骨微环境——“休眠微环境”（由HUVEC/HS-5细胞构建）和“恶性循环微环境”（由HUVEC/THP-1细胞构建），并系统研究了肿瘤条件培养基（CM）如何调控肺癌细胞（A549）的休眠、再激活及侵袭行为。通过对细胞形态、细胞周期、细胞因子分泌谱及关键基因表达的分析，揭示了与肿瘤休眠（如BMP-1, Wnt-5a, TGF-β2, MIP-3α）和侵袭（如CCL5, CXCL5, VCAM-1, CTSK, MMP-9）相关的潜在分子机制。该研究为肺癌骨转移的机制研究、药物筛选及靶向治疗策略开发提供了一个可控、可重复且具有生理相关性的体外研究平台。
引言与研究背景
癌症是全球主要的健康问题之一，其中肺癌的发病率和死亡率位居恶性肿瘤之首，且骨骼是其最常见的转移部位。骨转移是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞（“种子”）与骨微环境（“土壤”）之间的相互作用，经典的理论是“种子与土壤”假说以及转移前微环境的形成。传统的体外细胞培养和动物模型在研究癌症转移时存在局限性：体外培养缺乏生理条件和动态刺激，而动物模型难以精确控制和预测转移位点。近年来，器官芯片（Organ-on-a-chip）系统作为一种新型体外平台应运而生，它能够更真实地模拟人体器官的生理微环境、组织结构界面和生化信号。然而，目前多数用于研究骨转移的器官芯片采用简单的平行通道设计，无法复现骨骼组织高度血管化、多尺度的复杂血管网络结构，这限制了其对营养交换、细胞迁移和转移灶形成等过程的准确模拟。
本研究受叶脉和循环系统启发，基于团队前期的叶脉芯片工作，提出了一种新的研究策略。该研究并非旨在完整模拟整个转移级联过程，而是聚焦于利用这种具有层级结构的叶脉芯片平台，作为一个可控的体外微环境，来探究在模拟骨的腔室中，均匀稳定的剪切应力及被动的层级流分布如何影响肿瘤细胞的迁移和空间分布，从而实现对细胞行为在明确生物力学和结构线索下的定量研究。
叶脉芯片的设计、制备与表征
研究首先利用计算机辅助设计（CAD）软件设计了包含叶脉图案、入口、出口及六个用于装载水凝胶的腔室（直径2毫米）的芯片模型。通过光刻技术制作硅晶圆模具，并用聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇铸成型，最终与聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层组装成完整的微流控芯片。
对芯片的流体特性进行了系统表征。染料灌注实验表明，芯片能实现均匀的介质分布，并支持“一半一半”的灌注模式，允许在芯片两侧腔室维持不同的培养条件。使用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖进行灌注，证实了芯片通道与装载有纤维蛋白水凝胶的腔室之间能进行有效的物质交换。
通过计算流体动力学（CFD）模拟和粒子图像测速（PIV）技术，进一步分析了芯片内的流速和压力分布。模拟结果显示，叶脉芯片在通道和腔室周围能保持稳定的流速分布和对称的压力梯度。PIV实验比较了无分支、单分支、三分支、网格结构及叶脉结构等多种芯片设计的流体动力学性能。结果显示，叶脉芯片凭借其层级结构，能提供更均匀的流速场和剪切应力，同时其压力降（116.02 Pa）低于单分支和三分支结构。此外，荧光微珠灌注实验显示，相较于简单分支结构，叶脉结构进入腔室的微珠数量更少，提示其可能对灌注物具有一定的“过滤”或选择性效应，这有助于模拟肿瘤细胞在血管网络中的选择性归巢。
叶脉芯片中血管网络的构建
为了在芯片中构建功能性的血管网络，研究采用了分步接种的策略。首先，将表达绿色荧光蛋白（GFP）的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）封装在纤维蛋白水凝胶中，注入芯片腔室，培养3天后形成三维（3D）分支微血管网络。随后，将表达红色荧光蛋白（RFP）的HUVEC接种到芯片通道中，并通过多次灌注确保内皮细胞覆盖通道上下表面。经过动态灌注培养，腔室内的微血管网络与通道内的内皮层成功连接，形成了一个完整的内皮化微流体网络。活/死染色和免疫荧光染色（CD31， F-肌动蛋白）证实了细胞的高活性及血管网络的成功构建。内皮细胞在流动剪切力作用下沿通道方向排列，并表达血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）和剪切应力响应因子Krüppel样因子2（KLF2），表明形成了具有完整性和功能性的内皮层。
两种骨微环境的构建与肿瘤细胞实验
研究在叶脉芯片的腔室内构建了两种不同类型的血管化骨微环境，以模拟骨转移的不同阶段：
- 1.
休眠微环境：由HUVEC和人骨髓基质细胞（HS-5）共培养构成，模拟支持肿瘤细胞休眠的生态位。
- 2.
恶性循环微环境：由HUVEC和经佛波酯（PMA）诱导为M0表型的人单核细胞（THP-1）共培养构成，模拟促进肿瘤侵袭和骨破坏的“恶性循环”生态位。
为了模拟原发肿瘤对远处骨微环境的影响，研究使用了肺癌细胞系A549的条件培养基（CM）来预处理这些骨微环境，以构建转移前微环境。随后，将GFP标记的A549细胞灌注到芯片系统中，进行为期5天的动态培养，并系统分析肿瘤细胞的行为。
肿瘤休眠模型的发现与机制探究
在由HUVEC和HS-5细胞构成的休眠微环境中，离体细胞周期实验显示，与2D培养相比，共培养使A549细胞停滞在G0/G1期的比例显著增加（从38%升至60%），表明被诱导进入休眠状态。而当该微环境用CM预处理后，A549细胞G0/G1期比例下降（从60%降至40%），提示CM可唤醒休眠细胞。
在芯片上的实验结果与此一致。通过增殖标志物Ki67的免疫荧光染色进行定量，发现在正常培养基灌注下，第14天时仅有约22%的A549细胞呈Ki67阳性（即处于增殖期）。而在CM灌注的实验组中，Ki67阳性细胞比例上升至55%，证实了CM能够再激活休眠的肿瘤细胞。
通过对培养第9至14天收集的灌注培养基进行细胞因子阵列分析，以及在第14天收获腔室水凝胶进行实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析，探究了潜在的分子机制。研究发现，CM处理上调了血管生成素（angiogenin）、巨噬细胞炎症蛋白-3α（MIP-3α）、Wnt-5a和转化生长因子-β2（TGF-β2）的表达，同时下调了趋化因子CCL7。这些因子的变化表明，肿瘤分泌因子可能通过激活血管生成、促炎症反应以及上皮-间质转化（EMT）相关通路来再激活休眠肿瘤细胞。此外，骨形态发生蛋白-1（BMP-1）和骨桥蛋白（OPN）表达的改变，也暗示了其可能参与骨微环境的重塑。
肿瘤侵袭模型的发现与机制探究
在由HUVEC和M0 THP-1细胞构成的“恶性循环”微环境中，离体实验证实A549的CM能够有效诱导M0 THP-1向破骨细胞分化。在芯片实验中，通过侵袭伪足形成标志物皮质肌动蛋白（cortactin）的免疫荧光染色评估A549细胞的侵袭性。结果显示，在CM灌注的实验组中，A549细胞呈现出更明显的细胞伸长和伪足形成形态，且皮质肌动蛋白的平均荧光强度显著高于正常培养基组，表明CM促进了肿瘤细胞的侵袭行为。
细胞因子阵列分析显示，CM处理显著上调了趋化因子CCL5、CXCL5以及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的表达，这些因子与白细胞招募和肿瘤侵袭促进有关。RT-qPCR结果进一步表明，CM处理显著上调了破骨细胞分化相关基因组织蛋白酶K（CTSK）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9），以及CCL5和VCAM-1的表达。这些发现提示，在“恶性循环”微环境中，CM可能通过招募白细胞、增强破骨细胞活性及促进细胞外基质降解等途径，共同驱动肿瘤的侵袭性生长。
总结与展望
本研究成功开发并应用了叶脉芯片平台来研究肺癌骨转移。该平台能够支持“一半一半”灌注模式，确保充分的营养交换，并允许在腔室中构建组织特异性微环境，这些微环境能与周围的血管网络有效连接，模拟人体血管的结构与功能。研究系统分析了肿瘤细胞在两种不同骨微环境（休眠与侵袭）中的关键行为特征，并揭示了肿瘤条件培养基调控这些行为的潜在分子机制。这些机制涉及多种细胞因子和信号通路，为理解肺癌骨转移提供了新的视角。
尽管存在一些局限性，例如未来可通过小干扰RNA（siRNA）敲低等技术进行更深入的机制验证，或使用患者来源的肿瘤细胞/组织以增强临床相关性，但该叶脉芯片平台无疑为肺癌骨转移的病理机制研究、药物筛选及微环境靶向治疗策略的开发，提供了一个多功能、可控且具有生理相关性的强大体外工具，在个性化医疗和精准治疗方面展现出广阔的应用前景。
