基于催化钯纳米簇与氧化酶的纳米生物传感器用于汗液中葡萄糖和乙醇的双分析物电化学测定

《Advanced Healthcare Materials》：Nanobiosensor Based on Catalytic Palladium Nanoclusters and Oxidases for Bianalyte Electrochemical Determination: Glucose and Ethanol in Sweat

本工作开发了一种基于钯纳米簇(PdNCs)与葡萄糖氧化酶(GOx)/醇氧化酶(AOx)的双工作电极电化学纳米生物传感器，用于同步、无创检测汗液中的葡萄糖和乙醇。该传感器巧妙地利用氧化酶反应消耗局部溶解氧，进而影响PdNCs催化的氧还原反应(ORR)电流信号，实现对目标分析物的定量。该方法无需样品预处理，采用聚酰胺膜快速采集汗液，操作简便，适用于即时检测(POC)与自我分析，为代谢监测(如糖尿病管理)与酒精摄入评估提供了新型、便捷的解决方案。

　　

引言

无创监测生物体液中的代谢物正推动临床分析的变革。汗液作为一种易于获取的生物流体，是葡萄糖和乙醇等关键生物标志物的宝贵来源。电化学生物传感器因其灵敏度高、易于小型化且适用于即时检测而备受关注。其中，氧化酶因其高选择性而被广泛应用。钯纳米簇(PdNCs)作为一种纳米材料，对氧还原反应(ORR)和氢析出反应(HER)均表现出显著的催化活性，且相较于铂(Pt)，其自然丰度更高、成本更具优势，适合作为电极修饰材料。使用具有两个或更多工作电极(WE)的丝网印刷电极(SPE)卡，可实现多路复用分析。本研究旨在开发一种结合PdNCs纳米催化剂与氧化酶生物催化剂的混合型纳米生物传感器，用于汗液中葡萄糖和乙醇的双重同时测定。

实验部分

材料与试剂：合成PdNCs使用的前体盐为四氯钯酸钾，稳定剂为还原型DL-6,8-硫辛酸(DHLA)，还原剂为硼氢化钠。使用的酶包括来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOx)和来自博伊丁假丝酵母的醇氧化酶(AOx)。使用pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)。根据国际标准组织(ISO105-E04-2008 E)配方制备人工汗液。使用来自MicruX Technologies的柔性SPE，包括单工作电极(1WE-SPE，面积7.1 mm²)和双工作电极(2WE-SPE，每个电极面积2.3 mm²)两种型号。

仪器：使用紫外可见分光光度计、高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对PdNCs进行表征。电化学测量使用μ-Autolab Type II或μStat 200双恒电位仪。电化学阻抗谱(EIS)研究使用ECStat恒电位仪。

方法：

1. 1.
   PdNCs的合成：采用已报道的协议，在碱性水溶液中，用DHLA稳定，NaBH₄还原K₂PdCl₄。合成后，使用超滤离心管进行纯化。
   ?1）（蓝色）的1WE-SPE在10 mM PBS pH 7.0中获得的电化学测量结果比较；(B,C) 在不同时间通入O₂(B) 或 N₂(C) 后，在PBS中记录CV时，PdNCs修饰的1WE-SPE获得的电流密度。">
2. 2.
   单/双SPE的修饰：对于1WE-SPE，将6 μL含有4 μg mL^?1PdNCs的分散液沉积到WE上并干燥。对于2WE-SPE，使用1.5 μL分散液。当需要共同修饰酶时，则沉积PdNCs与GOx或AOx的混合液。
3. 3.
   使用单/双SPE的电化学测量：在SPE上滴加50 μL工作溶液，覆盖所有电极。在0至-1.2 V电位范围内以100 mV s^-1的扫描速率记录循环伏安图(CV)。使用-0.55 V处的电流或电流密度值处理结果。通过通入纯O₂或N₂来调节溶液中的溶解氧浓度。
4. 4.
   汗液样本的采集与测量：志愿者洗脸后进行30分钟中等强度有氧运动。使用选定的吸收材料（最终选择聚酰胺膜）从前额直接采集汗液。将吸附了汗液的膜立即放置于预先修饰好的SPE上进行测量。每次测量使用新的电化学池和汗液吸附膜。使用人工汗液制备的外部标准品进行校准。
5. 5.
   统计分析：结果以均值±标准差表示，使用配对样本t检验分析显著性差异。

结果与讨论

3.1 溶液中氧气的影响

PdNCs在ORR中表现出明显的催化活性。研究发现，PdNCs的催化电流密度受溶解氧浓度显著影响：通氧可增加电流，通氮则降低电流。这表明基于PdNCs ORR催化的分析信号会受到局部氧浓度变化的调控。尝试了三种将PdNCs与氧化酶结合的方法：用酶作为配体合成、生物共轭以及简单混合。结果发现，简单混合PdNCs与酶（GOx）的方案比生物共轭方案产生了更高的电流密度信号（-132 ± 12 μA cm^-2vs -88 ± 11 μA cm^-2），因此后续采用混合修饰法。

-1扫描速率在裸WE、生物修饰（GOx或AOx）WE、纳米修饰（PdNCs）WE以及生物纳米修饰（PdNCs/酶）WE上记录的LSV。(B) 在氧饱和PBS中，以1 mV s^-1扫描速率在裸WE、纳米修饰（PdNCs）WE、生物修饰（GOx）WE以及生物纳米修饰（PdNCs和GOx）WE上记录的LSV。">

3.2 基于PdNCs的纳米生物传感器的优化与表征

分别优化了葡萄糖和乙醇传感器的参数。对于葡萄糖检测，在1WE-SPE上沉积10 U GOx与PdNCs的混合液；对于乙醇检测，沉积0.5 U AOx与PdNCs的混合液。将测量温度从室温(RT)提高到37°C可显著提升两种传感器的灵敏度（葡萄糖提高1.8倍，乙醇提高1.2倍）。使用线性扫描伏安法(LSV)和塔菲尔(Tafel)分析研究了反应动力学，发现PdNCs修饰降低了ORR的起始电位，电荷转移系数接近0.5。电化学阻抗谱(EIS)表征表明，PdNCs修饰增加了电荷转移电阻(R_ct)，GOx修饰的电极表现出两个半圆，可能与蛋白质层的不同相有关。

3.3 单一纳米生物传感器的分析特性

在优化条件下，葡萄糖传感器在0.005–0.25 mg mL^-1范围内呈现良好线性(R²=0.994)，灵敏度为395 ± 13 μA cm^-2mg^-1mL。乙醇传感器在0.05–2.5 mg mL^-1范围内线性良好(R²=0.991)，灵敏度为48 ± 2 μA cm^-2mg^-1mL。传感器间精密度良好（葡萄糖RSD=4.5%，乙醇RSD=2.7%）。

-1之间；(C) 乙醇浓度在0.05至10 mg mL^-1之间。(B,D) 分别在0.1 mg mL^-1葡萄糖和1 mg mL^-1乙醇溶液中记录的七次伏安图。">

3.4 用于葡萄糖和乙醇同时测量的多路复用传感器

为实现同步测定，使用2WE-SPE，其中一个WE修饰PdNCs/GOx混合物，另一个修饰PdNCs/AOx混合物。研究表明，酶的加入不会阻塞PdNCs的活性位点。当测量含葡萄糖或乙醇的人工汗液时，电流密度仅在修饰了对应酶的WE上降低，证明了氧消耗发生在电极表面局部区域，且在两电极间无明显扩散干扰，测量可在3分钟内完成以避免交叉影响。该传感器对汗液中常见的干扰物（如尿素、尿酸、抗坏血酸、乳酸、铵离子）具有良好选择性。稳定性测试表明，传感器在室温下可稳定保存5天以上，在4°C下至少可保存14天。

-1)或乙醇(2.5 mg mL^-1)的人工汗液溶液中，使用一个WE修饰PdNCs/GOx（绿色）、另一个修饰PdNCs/AOx（红色）的2WE-SPE获得的电流密度。">

3.5 汗液样本中葡萄糖和乙醇的测定

比较了聚酰胺膜、棉垫和氧化铝圆盘三种汗液采集材料。聚酰胺膜因吸收体积小（约2.2 μL）、均匀性好、成本低而被选为最佳采集材料。将吸附汗液的膜直接置于修饰好的2WE-SPE上进行测量。

在人工汗液中使用聚酰胺膜校准，葡萄糖(0.01–0.25 mg mL^-1)和乙醇(0.1–2.5 mg mL^-1)均获得良好线性，检测限分别为0.02 mg mL^-1和0.15 mg mL^-1。对真实汗液样本的分析表明，摄入含糖能量饮料后，汗液葡萄糖水平显著升高；摄入酒精饮料后，汗液乙醇水平显著升高，而葡萄糖水平变化不一。在健身房进行的现场概念验证测试中，使用该纳米生物传感器测量的汗液葡萄糖和乙醇浓度变化趋势，与血糖仪和酒精呼气分析仪的测量结果具有一致性。汗液葡萄糖浓度约为血液浓度的8.6–9.5%，而汗液乙醇浓度比血液浓度高约70–110%，与文献报道相符。

结论

本研究成功开发了一种用于汗液分析的多分析物酶促纳米生物传感器。该传感器基于PdNCs对ORR的电催化信号受局部氧浓度调控的原理，通过氧化酶反应间接测定其底物（葡萄糖和乙醇）。使用具有两个WE的SPE，通过空间分离修饰不同氧化酶，实现了双分析物的同步、选择性测定。采用聚酰胺膜采集汗液，无需样品预处理或外加强化液，分析快速简便。传感器具有低检测限、良好选择性与稳定性，并已成功应用于真实汗液样本及现场环境（健身房）检测，结果与标准方法具有可比性。该方法易于使用，平台灵活、可抛弃，可与连接智能手机的小型化双恒电位仪联用，为实现代谢物无创监测的即时检测与未来可穿戴应用提供了有前景的方案。此原理可拓展至其他氧化酶底物的检测，具有广泛的应用潜力。