《Advanced Healthcare Materials》：Aqueous Two-Phase Bioinks for Discrete Packing and Compartmentalization of 3D Bioprinted Cells
编辑推荐：
本文综述了一种新型水性双相系统（ATPS）生物墨水，该系统基于明胶甲基丙烯酰（GelMA）和海藻酸，通过调控氯化钠（NaCl）浓度实现水包水（W/W）乳液的可控相分离。研究利用微流控辅助3D生物打印技术，成功打印出具有分区结构的细胞负载支架，实现了细胞的空间定位和聚集调控。实验表明，该墨水能支持多种细胞（如A549、C2C12、MG63、HBMSCs）的高活力、铺展与分化，并促进人骨髓间充质干细胞（HBMSCs）的成骨分化。在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型中，高盐浓度（36 g/L）支架展现出显著的血管浸润能力。该工作为组织工程与再生医学（TERM）提供了一种具有微尺度精度的复杂组织构建平台，拓展了生物制造策略的应用潜力。
引言与背景
水性双相系统（ATPS）是一种液-液分配系统，传统上用于蛋白质、病毒和酶等生物分子的分离、纯化与富集。与油包水（O/W）体系不同，ATPS能够维持细胞封装，为生物工程应用提供生物相容的环境。常见的成相剂包括聚乙二醇（PEG）和葡聚糖等聚合物，或PEG与盐（如磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐）的组合。相分离由热力学力驱动，通过聚合物与水分子之间的焓相互作用形成两个不同的水相。近年来，ATPS在组织工程与再生医学（TERM）中展现出新兴潜力，其可通过相分区实现细胞和生物分子的空间组织调控，这对于模拟天然组织环境和构建组织再生新模型至关重要。ATPS的水性组成赋予其生物相容性，能够支持活细胞的活力、增殖和分化。在3D生物打印领域，ATPS已被用于开发生物墨水，其水基特性可实现细胞和生物材料的精确沉积，创建复杂组织结构并保持高细胞活力。然而，ATPS固有的低粘度和低弹性模量限制了其在挤出式3D生物打印中的应用，为此需借助微流控辅助打印等策略来克服。
ATPS生物墨水的设计、表征与性能调控
本研究开发了一种新型ATPS生物材料墨水，其基于GelMA和海藻酸，通过改变氯化钠（NaCl）浓度（0-36 g/L）诱导相分离，形成水包水（W/W）乳液。NaCl的添加通过盐析效应发挥关键作用：离子强度增加降低了GelMA和海藻酸的混溶性，在两水相之间产生界面张力并减少静电排斥。研究构建了一个ATPS配方库，通过宏观观察和共聚焦显微镜证实，随着NaCl浓度增加，分散相（GelMA）体积分数逐渐增大，乳液液滴尺寸（12.8 ± 2.6 至 52.4 ± 11.4 μm）也随之增加。当NaCl浓度从9 g/L增至36 g/L时，液滴平均直径从12.7 ± 2.7 μm增至45.7 ± 7.42 μm。同样，增加GelMA浓度（3%至7%）也会导致液滴平均直径从14.4 ± 2.2 μm增至32.3 ± 7.4 μm。研究未观察到液滴在长达约45分钟的打印过程中发生聚并。
流变学分析揭示了NaCl浓度对ATPS粘度和粘弹性的调控作用。在低盐浓度下，粘度主要受连续相中总聚合物浓度影响；随着盐浓度增加，分散相液滴的体积分数和堆积程度提高，液滴间的相互作用和变形成为影响粘度的主导因素。在振荡实验中，复粘度在低频下出现峰值，表明ATPS在长时间尺度下表现出弹性行为，且该弹性随NaCl浓度增加而增强。力学谱图显示，随着NaCl含量增加，储能模量超过损耗模量的频率范围扩大，表明ATPS获得了更显著的类固体特性。
微流控辅助3D生物打印与支架结构
由于ATPS墨水本身粘弹性较低，研究采用了微流控辅助3D生物打印策略来实现其可控沉积。该平台使用定制的流动聚焦微流控打印头，ATPS墨水作为核心流，CaCl2交联溶液作为鞘流，通过离子交联使海藻酸瞬时凝胶化，从而在空气中逐层沉积单相或双相网格结构。通过光学相干断层扫描（OCT）和扫描电子显微镜（SEM）对打印支架进行表征，结果显示，单相（0 g/L NaCl）支架内部结构均匀致密，而双相（36 g/L NaCl）支架则呈现出由双相性质诱导的内部连通孔隙结构。溶胀实验表明，两种系统的纤维直径在12小时内均无显著变化，随后出现轻微增加，这归因于离子强度差异导致的静电排斥变化。选择性降解实验证实了支架结构的双相特征：在双相系统中，海藻酸形成连续的外基质，而GelMA主要局限在内部区域。去除海藻酸会导致整个结构坍塌，而去除非交联的GelMA则会在支架内部留下空隙。体外降解测试表明，含有化学交联GelMA的支架比仅物理交联海藻酸的支架更稳定。
细胞行为与生物功能研究
研究将多种细胞系（A549肺癌细胞、C2C12小鼠成肌细胞、MG63人骨肉瘤细胞、人骨髓间充质干细胞HBMSCs）封装于ATPS墨水中进行3D生物打印。活/死染色显示，所有条件下的细胞在长达7天的培养中均保持高活力，并且含GelMA的支架中细胞活力随培养时间显著增加。细胞的空间分布受ATPS分区结构的显著影响。在含交联GelMA的双相支架中，细胞倾向于在GelMA富集区域聚集和铺展。特别是当NaCl浓度达到36 g/L时，GelMA液滴尺寸更大，细胞更集中地定位于液滴内部并沿其表面生长，细胞形态更加伸长（圆形度值更低）。相比之下，在去除GelMA或单相（0 g/L NaCl）系统中，细胞分布则更为随机。
研究重点关注了HBMSCs在ATPS支架中的行为。细胞活力在所有盐浓度下均保持良好。重要的是，ATPS支架促进了HBMSCs的成骨分化。当在成骨培养基中培养时，支架中HBMSCs的成骨关键基因（如OSX、RUNX2、ALP）表达显著上调。免疫荧光染色显示，BMP-2蛋白在GelMA液滴区域积累增强。碱性磷酸酶（ALP）染色进一步证实，培养7天后，成骨培养基处理的支架中ALP活性显著高于基础培养基组，且高表达主要定位于GelMA液滴内部。研究指出，ATPS的分区化结构促进了“细胞聚集”，即细胞在GelMA富集区域内局部密度增加，这种空间限制增强了细胞间及细胞与生物材料间的相互作用，从而有利于谱系特异性分化。
体内血管化评估
研究利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型评估了ATPS构建体的血管化潜能。将含有或不含血管内皮生长因子（VEGF）的支架植入鸡胚培养一周。结果显示，与未加VEGF的对照组相比，添加VEGF显著促进了血管生长。尤其在高盐浓度（36 g/L）的支架中，血管浸润和支架与周围组织的整合更为明显。植入24小时后，36 g/L支架已出现明显的松散和整合迹象，而0 g/L支架则保持了较完整的结构。定量分析（Chalkley评分）表明，36 g/L + VEGF组的传入血管数量显著高于其他组，血管密度约为0 g/L对照组的2倍。这表明，高盐浓度和VEGF的协同作用能够有效刺激新血管形成。
结论
本研究成功开发了一种基于GelMA和海藻酸的ATPS生物墨水，通过调控NaCl浓度可精确控制W/W乳液的相分离和液滴特性。微流控辅助3D生物打印技术克服了ATPS墨水低粘弹性的挑战，实现了具有明确内部结构支架的稳定制造。该ATPS系统支持多种细胞的活力、空间组织以及功能分化，特别是能引导HBMSCs的成骨分化和促进血管浸润。其分区化结构为在单一样品内创建受控的微尺度细胞微环境提供了独特平台。总之，这种ATPS生物墨水为组织工程与再生医学领域构建具有微尺度精度和复杂层级结构的组织提供了多功能且强大的工具。
