《Bioengineering & Translational Medicine》：Fostering cell–cell interactions and integrating angiocrine factors to promote the development of salivary microtissues in 3D
1 INTRODUCTION 引言
唾液腺是一个由球状腺泡通过管状导管以树状结构连接而成的器官，负责唾液的生产、运输和分泌，以维持口腔稳态。头颈癌的放射治疗会损伤唾液腺，导致68%–85%的患者出现持续性口干（或称口干症）。由于唾液分泌减少和成分改变，患者的生活质量严重受损，症状包括口腔干燥、言语和吞咽困难，并易发龋齿和牙周病。目前针对口干症的临床解决方案旨在放疗期间保护唾液腺、使用水或口腔促泌剂缓解症状，或使用胆碱能毒蕈碱受体激动剂刺激剩余唾液腺功能，但均未提供长期疗效。唾液腺组织工程为辐射诱导的口干症提供了一个有前景的长期再生解决方案。使用含有组织的唾液腺腺泡样结构的生物相容性水凝胶开发的植入式唾液腺仿生体，可在患者放疗后植入以恢复功能。
研究团队之前通过将原代成人唾液腺干细胞/祖细胞（hS/PCs）封装在定制的、基于透明质酸（HA）的水凝胶中，并在肝细胞培养基（HepatoSTIM: HEP）中培养，开发了工程化唾液腺。在ROCK抑制剂存在下，单独分散的hS/PCs生长成正确极化的前腺泡多细胞结构。然而，与天然腺体不同，在这些水凝胶中形成的多细胞结构不够密集、互连或呈树状层次化组织。在培养的最初3天，hS/PCs以孤立的单细胞形式存在于合成基质中，缺乏对维持上皮细胞表型和功能至关重要的紧密细胞间接触。另一方面，自组装的多细胞结构再现了发育组织的结构和组织，具有增加的细胞间接触。与单细胞相比，自组装球体表现出更类似于天然组织的基因表达谱。
成功构建功能组织需要适应和重新激活关键的发育程序。在胚胎唾液腺形成过程中，分化的腺体上皮细胞与周围脉管系统之间的密切串扰有助于形成成熟腺体的层次结构。由内皮细胞和间充质来源的周细胞支持细胞组成的组织特异性血管微环境，部署一系列血管分泌因子以指导器官发育。具体而言，内皮细胞促进KIT阳性（一种受体酪氨酸激酶）的祖细胞扩增并抑制过早的导管分化。涉及血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR2）的信号传导是唾液腺上皮模式形成所必需的。重要的是，早期器官模式形成不需要功能齐全、可灌注的血管；原始脉管系统足以指导组织形态发生。内皮细胞分泌血管分泌因子，如生长因子、粘附分子和趋化因子，影响器官中的其他细胞类型并促进再生。这些因子的分泌谱具有组织特异性。这些分泌因子有助于在稳态期间维持干细胞和祖细胞处于静止状态，并可在损伤后以组织特异性方式促进再生。血管分泌因子也已知可调节上皮细胞的增殖、极化和分化。在成体组织中，与上皮相关的微血管不仅在维持组织稳态中发挥重要作用，还能保护唾液腺免受辐射诱导的组织损伤。
理解没有直接异型细胞间接触的上皮-内皮串扰对于开发可行的人工唾液腺至关重要。本文研究了血管信号对hS/PC表型的影响。使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和hS/PCs，首先确定了适合同时维持两种细胞类型的培养基和水凝胶条件。接下来，将hS/PCs在琼脂糖微孔中在各种培养基条件和培养时间下进行无支架培养，以形成成熟的自组装上皮球体。然后将这些预组装的hS/PC球体封装在细胞粘附性、蛋白酶可降解的HA水凝胶中，带有或不带有贴壁的内皮细胞单层。研究发现，在HA凝胶中培养预组装的hS/PC球体导致形成小叶状和互连的上皮结构，并在单个小叶周围有纤连蛋白沉积。在组织模拟共培养条件下，内皮细胞积极促进前腺泡和前导管祖细胞的发育。反之，上皮细胞也增强了内皮细胞的功能。作为对工程腺体进行体内测试的第一步，评估了水凝胶载体在部分切除的大鼠腮腺中的生物相容性。本研究证明了上皮细胞间粘附、基质条件和可溶性血管分泌因子在开发生物工程唾液腺中的重要性。
2 EXPERIMENTAL METHODS 实验方法
详细的实验方法，包括细胞分离/维持、3D培养、凝胶植入以及分子、细胞和组织分析，在补充信息S1中提供。引物和抗体信息可在表S1和S2中找到。
3 RESULTS 结果
3.1 EGM2适用于hS/PCs和HUVECs的维持
为了便于上皮细胞和内皮细胞的直接共培养，首先分析了两种细胞类型在HEP、EGM2以及HEP和EGM2的50/50混合物中的行为。虽然hS/PCs在所有三种类型的培养基中都能快速增殖，但只有在EGM2培养基中观察到HUVECs的稳健且显著的细胞增殖。在所有三种类型培养基中维持的hS/PCs持续表达唾液腺干细胞/祖细胞标志物角蛋白5（K5）和14（K14）。然而，对于HUVECs，仅在使用纯EGM2培养基时观察到内皮细胞标志物——维持内皮完整性和调节血管通透性的重要跨膜蛋白血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）以及内皮细胞中重要的粘附分子、对维持血管完整性和促进血管生成至关重要的血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1或CD31）的稳健表达。HEP中生长的HUVECs的CD31染色稀疏且呈斑点状。对于EGM2培养，CD31出现在细胞-细胞连接处，而对于在混合培养基中维持的细胞，信号大多在细胞内，表明表型变化。总体而言，虽然hS/PCs可以耐受所有三种培养基类型，但用HEP稀释EGM2培养基会损害内皮细胞功能。
3.2 EGM2培养基促进hS/PC聚集体的组装和成熟
在培养3天和7天后，琼脂糖微孔中产生了直径在90到120微米之间的球形和不规则形状的hS/PC聚集体，与培养基成分无关。可以看到几条松散相关细胞的链从细胞聚集体的主体辐射出来。到第7天，在含EGM2的培养基（EGM2和EGM2/HEP混合物）中形成的结构表现出清晰平滑的边界。活/死染色显示，在整个培养期间，细胞保持活力，与培养基成分无关。平均而言，第3天和第7天分别有84%和87%的细胞存活。虽然差异不显著，但在EGM2中发育的第7天聚集体比其他条件下形成的聚集体具有更高的活力。
在转录水平上，第3天，在EGM2培养物中干细胞/祖细胞标志物KRT5的表达低于HEP培养物。将培养时间延长至第7天增加了KRT5的表达。另一个干细胞/祖细胞标志物KRT14也观察到类似的表达模式。ETV4和ETV5是唾液腺中祖细胞维持所需的转录因子。第3天，ETV4水平在HEP培养物中最高。相比之下，第3天ETV5在不同培养基条件下表达保持较低，但到第7天显著增加。第7天的HEP和EGM2培养物表达了最高水平的另一个干细胞/祖细胞标志物MYC。对于EGM2培养物，从第3天到第7天表达上调了3.3倍。最后，KIT配体KITLG（也称为干细胞因子）的最高表达水平在第3天的HEP培养基中检测到。到第7天，三种培养基条件下的表达水平相当。
RT-qPCR分析显示，第7天的HEP/EGM2培养物表达了最高水平的腺泡标志物AQP5，与各自第3天的培养基对照相比，所有培养基条件在第7天AQP5表达均显著增加。α-淀粉酶编码基因和腺泡标志物AMY的表达在第7天的EGM2培养物中最高。与各自的第3天培养基对照相比，在HEP、混合和EGM2培养基中，AMY表达分别增加了15.1倍、5.5倍和7.9倍。钠-钾-氯共转运体1（NKCC1）编码基因SLC12A2的表达在第7天高于第3天，并且EGM2在第7天诱导了与HEP相似水平的表达。HEP/EGM2培养物分别在导管细胞分化（尤其是小叶间导管）转录因子TFCP2L1的第3天表达最高，第7天表达最低。
接下来，分析了编码细胞外基质（ECM）蛋白（LAMA1，层粘连蛋白α1；FN1：纤连蛋白）的基因。从第3天到第7天，LAMA1表达增加，第7天的EGM2培养物表达了最高水平的LAMA1。FN1的表达谱遵循类似的模式。延长培养时间和添加EGM2导致FN1表达稳步增加；同样，最高的FN1水平在第7天的EGM2培养物中检测到。最后，检查了编码参与细胞间（CDH1，E-钙粘蛋白）和细胞-ECM（ITGB1，整合素β1）粘附的蛋白质的基因。添加EGM2导致第3天和第7天CDH1的显著上调，最高表达在EGM2培养物中检测到。虽然EGM2培养物表达了比第3天的HEP对照更高水平的ITGB1，但ITGB1表达不受培养基成分和培养时间的显著影响。
额外的实验使得能够比较球体和单层培养物之间的基因表达。基于微孔的第3天和第7天3D球体培养显著增加了KRT5、KRT14和SLC12A2的表达，但降低了TFC2PL1和CDH1的表达。虽然第3天的球体表达更高水平的ETV4，但第7天的球体表达水平与各自的2D培养物相当。相反，第7天球体中观察到更高水平的ETV5，但第3天球体中没有。与2D培养物相比，hS/PC球体中的AMY表达在第3天显著降低，然后到第7天显著增加。
在蛋白质水平上通过免疫荧光，微孔衍生的hS/PC聚集体在所有培养基条件下在第3天和第7天对K5和NKCC1呈阳性染色。总体而言，在EGM2中组装的第7天hS/PC聚集体表达了高水平的干细胞/祖细胞标志物（KRT5、KRT14、MYC）、腺泡标志物（AMY、SLC12A2）；3D组装体的成熟通过高表达的ECM蛋白（LAMA1和FN1）和细胞间粘附模块（CDH1）得到证明。因此，后续实验使用EGM2衍生的第7天hS/PC聚集体。
3.3 HA基水凝胶支持内皮细胞单层的发育
为了评估合成基质支持内皮细胞的能力，将悬浮在EGM2中的HUVECs接种在预先形成的带有RGD的HA水凝胶顶部。细胞随时间增殖，到第14天，建立了具有紧密细胞间接触的汇合单层。在整个培养期间，细胞活力保持较高水平（>92%）。细胞单层形成后，内皮细胞标志物的表达显著增加。RT-qPCR实验显示，血管内皮生长因子VEGFA及其受体FLT1的表达分别增加了4.9倍和11.0倍。经典内皮细胞标志物——冯·维勒布兰德因子（vWF）的表达上调了26.6倍。同时，细胞连接蛋白CD31（PECAM1）和VE-钙粘蛋白（CDH5）的表达分别上调了15.1倍和20.6倍。在蛋白质水平上，HUVECs对CD31和VE-钙粘蛋白呈阳性染色，荧光信号定位于细胞间连接处。也检测到中间丝波形蛋白的明亮的细胞质染色。当用冯·维勒布兰德因子（vWF）染色时，最大荧光信号集中在细胞核周围的Weibel-Palade体中，细胞质中有弥散信号。总体而言，含RGD的HA凝胶支持内皮细胞的附着和生长。
3.4 预组装的hS/PC球体在HA凝胶中继续扩张
将预组装的hS/PC球体封装在柔软（G′ = 300 Pa）的蛋白酶可降解HA凝胶中，其中含有2.5 mM RGD肽，并将所得的3D上皮单一培养物在EGM2培养基中维持长达14天。细胞活力在整个培养期间保持较高水平（>88%）。到第14天，球形聚集体已生长成复杂的小叶状结构，其中单个小叶通过广泛的F-肌动蛋白结构相互连接。通过RT-qPCR检查3D水凝胶单一培养物发现，在mRNA水平上，从第2天到第7天和第14天，KRT5和KRT14的表达保持不变。与第2天的水平相比，KIT的表达在第7天和第14天显著增加。KITLG的表达遵循类似的趋势，尽管倍数增加更为温和。从第2天到第7天，细胞对MYC、ETV4和ETV5的表达分别增加了1.9倍、1.5倍和1.5倍。到第14天，表达恢复到第2天的基线水平。
hS/PC球体的3D水凝胶单一培养导致细胞腺泡标志物表达随时间逐渐增加。与第2天的培养物相比，AMY的表达在第7天和第14天分别增加了2.2倍和2.8倍。类似地，AQP3的表达在第7天增加了2.1倍，在第14天增加了2.4倍。同时，到第14天检测到AQP5表达增加1.9倍，SLC12A2表达增加2.3倍。虽然早期导管标志物KRT7和KRT19的表达保持不变，但成熟导管标志物TFCP2L1的表达在第7天和第14天分别上调了5.6倍和4.3倍。在第7天和第14天分别观察到LAMA1和FN1的表达上调。在第14天检测到ITGB1表达增加2.0倍，而CDH1的表达在整个培养期间保持不变。
在蛋白质水平上，免疫细胞化学分析显示，对中间丝K5和K14呈阳性细胞质染色，对CD44呈阳性膜染色，证实了在3D培养中干细胞/祖细胞状态的维持。小叶结构内的所有细胞都显示α-淀粉酶阳性细胞质染色。微组织在细胞间接触处对整合素β1也呈阳性染色，与皮层F-肌动蛋白重叠。有趣的是，第14天的小叶结构在每个小叶周围表现出纤连蛋白的细胞外沉积。虽然在组织培养板上维持的2D中的一些hS/PCs对导管标志物K7和K19呈阳性染色，但这些信号在自组装球体中缺失。总体而言，水凝胶封装后，预组装的hS/PC球体生长成更复杂的细胞结构，具有由前腺泡祖细胞组成的多小叶结构。
3.5 HUVECs在没有直接细胞-细胞接触的情况下调节hS/PC功能
通过将预组装的hS/PC球体封装在含有RGD的块状HA水凝胶中，并将HUVECs接种在上皮构建体顶部，建立了上皮-内皮共培养。在EGM2中培养14天后，多细胞上皮结构和内皮细胞单层在形态上与各自单一培养中发育的相似。没有观察到内皮细胞向上皮隔室浸润，上皮细胞在没有延伸到内皮单层的情况下仍然聚集在水凝胶中。因此，两种细胞类型很容易分离，用于通过RT-qPCR分析它们各自的表型标志物。首先，进行实验以评估时间基因表达。与第2天相比，hS/PCs在第14天表达了显著更高水平的KRT5、KRT14和ETV4。虽然ETV5表达不变，但MYC表达降低。14天的共培养导致腺泡标志物AMY、AQP3、SLC12A2和ANO1表达的显著上调。这伴随着导管标志物KRT7和TFCP2L1的表达分别增加2.1倍和5.3倍。虽然LAMA1表达没有变化，但观察到Ki67、CDH1和FN1的显著上调。重要的是，在EGM2中进行14天的共培养导致HUVECs中所有检查的内皮细胞标志物（包括VEGFA、FLT1、PECAM1、CDH5和vWF）的显著上调。
接下来，将第14天的共培养基因表达与各自的单一培养进行比较。添加内皮细胞导致上皮细胞祖细胞标志物（KRT5、KRT14、ETV5）、腺泡标志物（AMY、AQP3、SLC12A2）和导管标志物（KRT7、TFCP2L1）表达的显著增加。虽然ETV4、LAMA1和KRT19的表达不受内皮细胞影响，但CDH1和FN1的表达分别上调了1.9倍和6.1倍。包含hS/PCs也对HUVECs产生了深远的影响。具体而言，在共培养中维持的内皮细胞比单一培养表达了更高水平的FLT1、vWF、PECAM1和CDH5。总体而言，在没有直接异型细胞间接触的组织模拟配置中并列两种细胞类型，增强了两者细胞类型的分化和成熟。
3.6 HA基水凝胶在部分切除的腮腺中被耐受
为了模拟腺泡细胞损失，切除了1/3的大鼠腮腺并用植入物水凝胶替换。为了能够进行体内成像，在植入前用近红外染料Cy7标记水凝胶。在植入部位，接收Cy7标记凝胶的动物在第0天显示直径约5毫米的明亮荧光区域。在接受无染料水凝胶的动物切除的腮腺中未检测到荧光信号。标准化到第0天水平的辐射效率随时间逐渐降低，到第21天，组织中仅残留小凝胶碎片。分别地，在术后第7天和第21天处死接受水凝胶植入的动物，取回腮腺并进行H&E和马松三色染色。健康、未经处理的腮腺显示紧密排列的腺泡、组织良好的导管和最小的基质浸润，具有整体小叶结构。切除腺体的H&E染色显示，手术后第7天和第21天存在混合炎症细胞浸润、小叶萎缩和慢性出血。马松三色评估表明，切除手术后第7天，腺体周围结缔组织有中度区域性增加。即使在切除手术后21天，这一观察结果也没有改变。
第7天，植入的水凝胶被腺体边缘的慢性肉芽肿性异物型炎症浸润所包围，同时邻近组织有纤维囊和轻度混合炎症细胞浸润。观察到伴有导管扩张和鳞状上皮化生的轻度多灶性小叶萎缩。正如马松三色染色所观察到的，腺体周围结缔组织有中度增加。在水凝胶植入后第21天也看到了类似的结果。这些结果表明，HA基水凝胶可以在腮腺中局部生物降解。组织对水凝胶植入物的反应是轻微的，仅水凝胶本身并未减轻代偿性结缔组织浸润。
4 DISCUSSION 讨论
唾液腺组织工程中的一个重大挑战是产生具有最大化表面积和空间分隔的腺泡和导管的上皮微组织，以实现定向液体生产和运输。已经建立了从腮腺组织中分离和扩增原代人唾液腺干细胞/祖细胞的方案。这些细胞可以转化为前腺泡/前导管祖细胞以恢复分泌功能。为了生产工程腺体，hS/PCs作为单个细胞分散在各种基于HA的水凝胶中。研究发现，改变水凝胶构建块的组成、结构、分子量和蛋白酶敏感性会影响hS/PCs的克隆扩增、祖细胞状态的维持以及向腺泡细胞的分化。进一步发现，补充针对特定信号通路（TGFβ1和ROCK）的抑制剂深刻影响hS/PCs的表型和组织。重要的是，发现ROCK抑制导致正确极化的多细胞结构的建立。偶尔会看到在“裂隙”区域有增强纤连蛋白染色的融合结构，但没有形成互连的小叶结构。
在胚胎唾液腺发育过程中，通过分化上皮细胞和周围脉管系统之间复杂的串扰形成树状层次结构。唾液腺组织特异性血管微环境分泌各种血管分泌因子，控制器官形态发生。早期器官模式形成不需要功能齐全、可灌注的血管网络；原始脉管系统足以指导器官形态发生。在成熟的唾液腺中，与上皮密切相关的微血管在保护腺体免受辐射诱导的损伤中发挥重要作用。为了促进hS/PC分化和实现空间模式化唾液微结构的建立，将自组装的hS/PC球体嵌入细胞粘附性、蛋白酶可降解的HA水凝胶中，并将所得细胞构建体在存在血管信号（来自内皮细胞培养基或贴壁的HUVEC单层）的条件下培养。
初始的2D培养基筛选实验表明，虽然hS/PCs在EGM2培养基中容易生长，但HEP培养基不支持内皮细胞。这并不奇怪，因为除了EGF，HEP培养基不含关键血管生成生长因子，如成纤维细胞生长因子-2（FGF2）、VEGF、胰岛素样生长因子-1（IGF1）和抗坏血酸，这些都是维持内皮细胞功能不可或缺的。这些可溶性因子对上皮细胞的干细胞/祖细胞状态没有负面影响。基于HA的水凝胶虽然比明胶包被的组织培养板硬几个数量级，但在EGM2中也支持HUVEC的附着和增殖。浓度为2.5 mM的RGD足以用于细胞附着，无需明胶包被。添加EGM2后，培养基中的可溶性生长因子在平均孔径为70–100 nm的网络内外迅速平衡。因此，没有观察到HUVEC浸润到HA基质的块状区域。
hS/PCs在所有培养基条件下在琼脂糖微孔中形成多细胞球体。虽然球体在第3天形成，但将悬浮培养延长至第7天导致球体压实，可能是通过加强细胞间粘附（增加CDH1表达）和在细胞簇周围产生ECM蛋白（增加LAMA1和FN1表达）实现的。CDH1的上调可能促进分支和腺泡分化，因为阻断E-钙粘蛋白被证明会抑制唾液腺分支。在扩张的上皮结构周围产生和积累ECM是构建分支腺体组织的第一步。与我们的观察一致，先前的研究表明，在非粘附微孔中培养时间更长的预血管化真皮球体表现出增加的纤连蛋白、层粘连蛋白和I/IV型胶原表达。或者，作为预组装球体培养的牙髓间充质干细胞（MSCs）有助于软骨分化，脂肪来源的MSCs球体能够分化为肝细胞样细胞。
在EGM2培养基中延长悬浮培养也促进了hS/PCs向前腺泡祖细胞的发育，这通过在转录水平上关键干细胞/祖细胞和腺泡标志物表达的上调得到证明。在这里，EGM2中的可溶性因子作为血管分泌信号，有助于上皮球体的生长和成熟。EGF、FGF2和VEGF都被证明在维持祖细胞群体、调节上皮细胞增殖、萌芽和分支以及刺激腺泡/导管分化中至关重要。重要的是，在放射治疗前注射IGF-1已被证明可以通过激活内源性Akt和抑制细胞凋亡来保留唾液腺功能。在小鼠中，抗坏血酸被证明可以通过上调乙酰胆碱或β-肾上腺素能受体来增加唾液分泌。
在封装在HA凝胶后，自组装的hS/PC球体继续扩张，形成具有独特多小叶形态的复杂细胞结构。然而，个体腺泡样小叶并非通过导管结构连接；相反，延伸的F-肌动蛋白纤维连接了相邻的小叶。合成基质包含整合素结合的RGD肽和MM
